水稻抗白叶枯病基因Xa23的图位克隆

论文摘要

植物抗病基因的研究一直是植物分子生物学研究的热点之一,到目前为止已分离了近70个植物抗病基因。水稻中已经鉴定32个主效抗白叶枯病基因,其中Xa1、xa5、xa13、Xa21、Xa26和Xa27近年已被分离克隆。在众多的水稻抗白叶枯病基因中,被育种利用的并不多。所以克隆和研究新的抗白叶枯病基因是水稻抗病研究的客观要求。从我国普通野生稻中鉴定发掘的Xa23基因,具有抗谱广、完全显性、全生育期抗性等特点,并已培育成以金刚30（JG30）为背景的近等基因系CBB23。 本研究利用JG30与CBB23杂交F2代的2562个单株为作图群体,对Xa23基因进行精细定位;BAC文库构建;Shotgun文库测序;遗传转化等方法克隆Xa23基因。主要结果如下: 1.EST分子标记定位:根据日本水稻基因组计划RGP的数据,筛选并合成12个EST标记的引物,进行亲本间多态性检测。找到2个在CBB23与JG30间有多态性的标记C189和CP02662。用C189标记对F2群体中的571个感病单株进行分子检测和连锁分析,结果表明该标记与Xa23的遗传距离为0.8cM。将C189成功用于水稻分子育种实践,标记辅助选择的正确率接近100%。 2.利用相关基因组文库进行分子标记定位:通过筛选水稻明恢63的TAC文库和广陆矮4号的PAC文库,获得15个末端片段,其中6个末端片段在双亲间有多态性,分别为69B、81N、45B、45N、84N和84B。这些标记与Xa23的遗传距离依次为0.4、0.4、0.5、0.6、0.6和1.1 cM。加密了Xa23基因一侧的遗传图谱,并使其遗传距离缩短到0.4 cM。 3.开发新的PCR标记进行Xa23基因精细定位:依据国际水稻基因组计划测序的水稻品种日本晴的序列及上述定位的区域为依据设计特异引物,共开发出8个新的分子标记Lj13、Lj36、Lj46、Lj55、Lj204（Lj74）、Lj210、Lj211和Lj215。用这些标记对F2群体感病单株进行分子检测和连锁分析,标记Lj36、Lj46和Lj211与Xa23的遗传距离分别为0.4cM、0.3cM和0.2cM,位于同一侧,Lj13与Xa23的遗传距离为1.1cM,位于基因另一侧,Lj204（Lj74）、Lj210、Lj215和Lj55与Xa23的遗传距离为0cM,与Xa23基因共分离。 4.构建了CBB23 CopyControl pCC1 BAC文库,该文库包含36,096个克隆,平均插入片段108Kb,覆盖水稻基因组9.1倍。用紧密连锁标记Lj211和共分离标记Lj74筛选BAC文库,得到5个阳性克隆64F16、71H3、91A1、6O8和59F8,建立了跨叠克隆群,将Xa23基因锁定在BAC克隆6O8内,经脉冲电泳检测其插入片段为80Kb左右。 5.对BAC克隆6O8进行鸟枪法（Shotgun）全序列测定,成功获得72115bp的DNA连续序列。通过基因预测共有12个开放阅读框（ORFs）,分别编码不同的基因,根据ORF编码产物的同源性比较以及分子标记的位置,最后锁定6个ORFs为侯选基因。 6.运用农杆菌介导转化法将选取的10个侯选基因克隆载体转化到受体品种中,共得到1350株转基因苗。其中侯选基因载体T189转化受体牡丹江的258株T0代转基因苗,经田间接种鉴定,有23株表现抗病,其中17株表现高抗,6株表现中抗。其它侯选基因克隆的转基因苗对小种P6都表现感病。潮霉素基因Southern杂交检测抗病株拷贝数,高抗和中抗中既有单拷贝又有双拷贝,证明所有抗病株都是转基因。结果表明T189含有的基因就是本研究所克隆的目标基因Xa23,成功克隆Xa23基因。 7.BlastX分析表明,Xa23基因与已知的其它已克隆的植物抗病基因都不同源,说明Xa23基因是一类新型的抗病基因。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 目录
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物抗病基因研究进展
• 1.1.1 植物一病原菌互作的分子机制
• 1.1.2 植物抗病基因克隆策略及方法
• 1.1.3 已克隆的抗病基因及功能分析
• 1.2 水稻白叶枯病抗性基因研究进展
• 1.2.1 水稻白叶枯病概述
• 1.2.2 水稻对白叶枯病的抗性遗传研究
• 1.2.3 水稻白叶枯病抗性基因的分子定位
• 1.2.4 水稻白叶枯病抗性基因的分离克隆
• 1.2.5 水稻抗白叶枯病的分子育种
• 第二章 论文选题及技术路线
• 2.1 立题依据
• 2.2 研究目标、内容及方法
• 2.2.1 研究目标
• 2.2.2 研究内容
• 2.2.3 研究方法
• 2.3 技术路线
• 第三章 水稻抗白叶枯病基因Xa23的精细定位
• 3.1 前言
• 3.2 EST分子标记定位及辅助选择利用
• 3.2.1 材料与方法
• 3.2.2 结果与分析
• 3.2.3 讨论
• 3.3 利用相关基因组文库加密Xa23基因连锁图谱
• 3.3.1 材料与方法
• 3.3.2 结果与分析
• 3.3.3 讨论
• 3.4 开发新的PCR标记进行Xa23基因的精细定位
• 3.4.1 材料与方法
• 3.4.2 结果与分析
• 3.4.3 讨论
• 第四章 Xa23基因近等基因系CBB23的BAC文库构建及跨叠克隆群
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 植物材料
• 4.2.2 载体
• 4.2.3 BAC文库构建
• 4.2.4 BAC文库筛选
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 BAC文库构建条件的优化
• 4.3.2 CBB23 BAC文库构建
• 4.3.3 筛选阳性BAC克隆
• 4.3.4 构建覆盖Xa23基因的BAC跨叠克隆群
• 4.3.5 侯选阳性克隆的稳定性检测及插入片段大小
• 4.4 讨论
• 4.4.1 构建BAC文库优化体系的建立
• 4.4.2 快速筛选文库的方法
• 4.4.3 覆盖Xa23基因跨叠克隆群的构建
• 第五章 BAC阳性克隆的Shotgun文库构建、测序及生物信息学分析
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 BAC阳性克隆质粒DNA的提取
• 5.2.2 小片段DNA的制备
• 5.2.3 目标片段DNA与载体连接构建Shotgun文库
• 5.2.4 亚克隆文库的测序、拼接及预测
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 BAC阳性克隆质粒DNA的提取
• 5.3.2 目的片段DNA的制备
• 5.3.3 Shotgun亚克隆文库构建
• 5.3.4 Shotgun测序及拼接
• 5.3.5 生物信息学分析
• 5.4 讨论
• 5.4.1 Shotgun文库测序应注意的问题
• 5.4.2 序列拼接中的难题
• 5.4.3 基因组中的重复序列
• 5.4.4 关于Xa23基因座位
• 第六章 Xa23侯选基因的遗传转化及功能验证
• 6.1 前言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 水稻转化受体材料
• 6.2.2 筛选TAC文库
• 6.2.3 电极法转化农杆菌
• 6.2.4 水稻转化受体系统的建立
• 6.2.5 转基因植株的鉴定
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 筛选侯选基因的TAC克隆
• 6.3.2 农杆菌介导的水稻遗传转化
• 6.3.3 转基因植株的鉴定
• 6.3.4 Xa23基因分析
• 6.4 讨论
• 6.4.1 转化受体的选择
• 6.4.2 选取TAC表达载体的优点
• 6.4.3 田间接种鉴定验证转基因的可靠性
• 6.4.4 转基因植株分子检测与田间接种鉴定不统一的原因
• 6.4.5 Xa23基因是新类型的抗病基因
• 6.4.6 Xa23基因的应用前景
• 第七章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介