论文摘要
日本鬼鲉是一种有较高经济价值的的鱼类。本文从日本鬼鲉不同组织同工酶差异,基于Cyt b,COII基因序列的系统发育地位分析和多态性微卫星引物的筛选等三方面进行了研究。采用垂直聚丙烯酰胺平板电泳技术,对象山港野生日本鬼鲉的9种组织器官的8种同工酶进行研究,并分析了其酶谱表型。结果表明,琥珀酸脱氢酶在所有组织中均存在,组织间差异较小;乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸酶、酯酶、醇脱氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶则具有明显的组织特异性,且这些酶在表型、分布和活性上均表现出高度的组织特异性。根据鲉行目鱼类cyt b和COⅡ上下游保守序列各自设计引物,对日本鬼鲉的线粒体DNA进行PCR扩增,克隆并测定了cyt b和COⅡ因的全序列, COⅡ基因为691 bp和cyt b为1141 bp。从GenBank下载鲉形目28种鱼类的cytb部分或全序列和10种鱼类的COⅡ部分或全序列,然后进行比对分析,用NJ法和ML法构建分子系统发育树。系统发育树结果显示:线粒体cytb和COⅡ基因序列构建的分子系统树,和传统分类方法的结果基本一致;毒鲉科的日本鬼鲉和鲉科的关系最近;在飞角鱼科（Dactylopteridae）是否属于鲉形目还是单独成飞角鱼目的问题上,本研究比较支持飞角鱼科（Dactylopteridae）独立归成飞角鱼目（Dactylopteriformes）。鲉形目的COⅡ与昆虫类的COⅡ不同,鲉形目的COⅡ基因比cyt b基因保守,即COⅡ基因比cyt b基因进化慢。COⅡ基因进化树相应的节点上数值稍微较高。用磁珠富集法构建的日本鬼鲉基因组微卫星文库中共有近1000个单菌落。随机挑选352个克隆用载体引物进行第二次筛选,获得阳性候选克隆262个并随机选择了174个克隆进行测序。测序结果表明,156个克隆含有明显（重复次数大于5次）的微卫星重复单元,共含有181个微卫星结构域。两碱基重复次数大于12或三碱基重复次数大于8的克隆共67个。所获得含微卫星的序列总长度范围是152-854bp,平均长度在330 bp左右。其中两碱基重复单元出现的次数最多,占所有分离的微卫星数目的79.0%,三碱基重复单元出现的次数居次,10.5%,此外还发现一碱基重复,四碱基重复,五碱基重复等多种重复类型,共占分离微卫星数目的10.5%,在获得的181个微卫星位点中,完美型微卫星序列共有98个,占54.1% ;非完美型的66个,占36.5% ;复合型的17个,占9.4%。对两碱基复次数大于12或三碱基重复次数大于8的克隆的67个克隆,用Primer premier 5.0引物设计软件设计65对引物,并随机挑选32个合成。用32对引物在厦门日本鬼鲉群28个个体进行PCR扩增,筛选出25对有效扩增的微卫星引物,其中19对微卫星引物在此群体有高度多态性。每个位点等位基因个数（A）在4-14之间,观察杂合度在0.500–0.892之间,期望杂合度0.521–0.914之间。有两个位点（J004, IJ014）严重偏离Hardy-Weinberg平衡。本文首次报道了日本鬼鲉微卫星DNA标记的多态性筛选,在毒鲉科鱼类中也尚属第一次。