光敏蛋白vivid的性质研究和应用

论文摘要

光敏蛋白是一类在生命体内能够应答光信号而产生生理学反应的蛋白,它们也被称为“光信号感受器”,它们在生物钟调节、细胞信号传递等方面有重要的生理意义。本论文从粗糙脉孢菌中提取了一种生物钟调节基因vivid,把它克隆到pET28中,成功地进行了蛋白表达和纯化,随后进行其性质研究和应用,主要包括FAD含量测定、光敏性—光恢复和光激活两方面研究、二聚化和四聚化研究、作为光敏探针应用于intein模型研究。结果表明,vivid蛋白FAD含量为35%,光恢复时间受温度影响且呈反比关系,不同vivid突变体光恢复速率各不相同,其中vivid36对温度敏感度最高,通过改变vivid蛋白中个别氨基酸可以优化和调节其光恢复特性；用单色仪产生的连续光和飞秒激光器产生的脉冲光对vivid蛋白光激活进行测试,结果表明400-490nm之间的光均能使vivid36蛋白激活,其中450nm激活速率最快,470nm次之,500nm以上光不能激活蛋白；vivid36光激活速率与光强呈正比,光强越大,光激活速率越快,连续光和脉冲光对vivid36激发情况基本一致。用分子筛层析方法验证了vivid蛋白二聚化的特性,随后两个vivid串联蛋白的分析未发现明显的四聚化现象,但可以看到蓝光激发后,vivid蛋白能与FAD共价结合。由vivid蛋白光敏性和二聚化特性设想将其应用于介导intein剪接反应,选择VMA intein作为载体,设计了顺式剪接和反式剪接两种模型,构建vivid和VMA intein融合蛋白,蛋白表达纯化后进行FAD含量测定,结果表明融合蛋白FAD含量几乎为0,不能表现出vivid蛋白特有活性,由于vivid蛋白本身结构和活性特点导致其在大肠杆菌中正确折叠较为困难,说明目前还不适合将vivid蛋白广泛应用在光敏探针研究中。通过本文的研究,让我们对vivid蛋白性质有更深入的了解和认识,为其后续应用打下良好的基础,具有重要的科研价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 光敏蛋白研究意义
• 1.2 光敏蛋白研究概况
• 1.2.1 LOV家族
• 1.2.2 phytochrome
• 1.2.3 光敏蛋白应用
• 1.3 vivid研究概况
• 1.3.1 vivid来源
• 1.3.2 vivid研究进展
• 1.3.3 vivid蛋白性质研究
• 1.4 技术背景
• 1.4.1 飞秒激光
• 1.4.2 分子筛层析
• 1.4.3 内含肽
• 1.5 研究内容
• 1.6 论文创新点
• 第2章 vivid基因克隆、表达与纯化
• 2.1 实验思路
• 2.2 实验材料和试剂
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 实验仪器
• 2.2.4 主要溶液配制
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 Neurospora crassa基因组DNA提取
• 2.3.2 vivid基因克隆
• 2.3.3 vivid蛋白小量表达条件摸索
• 2.3.4 vivid蛋白纯化
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 vivid原核表达载体构建
• 2.4.2 小量表达条件摸索
• 2.4.3 vivid蛋白纯化
• 2.5 本章小结
• 第3章 vivid蛋白光敏性研究
• 3.1 实验思路
• 3.2 实验材料和试剂
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 突变体基因克隆及蛋白纯化
• 3.3.2 光恢复测定
• 3.3.3 用飞秒激光器进行光激活研究
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 蛋白表达和纯化
• 3.4.2 光恢复测定
• 3.4.3 光激活测定
• 3.5 本章小结
• 第4章 vivid蛋白二聚化及四聚化研究
• 4.1 实验思路
• 4.2 实验材料和试剂
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 pET28a-vivid36-1inker-vivid36基因克隆及蛋白纯化
• 4.3.2 Superdex 75 10/300 GL标准曲线绘制
• 4.3.3 vivid36二聚化分析
• 4.3.4 vivid36-linker-vivid36四聚化分析
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 标准曲线绘制
• 4.4.2 vivid蛋白二聚化分析
• 4.4.3 vivid-linker-vivid蛋白四聚化分析
• 4.5 本章小结
• 第5章 vivid在intein中应用
• 5.1 实验思路
• 5.2 实验材料和试剂
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 主要溶液配制
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 质粒构建
• 5.3.2 蛋白小量表达条件摸索
• 5.3.3 模型1蛋白纯化
• 5.3.4 模型1 intein反应操作及鉴定方法
• 5.4 结果与讨论
• 5.4.1 质粒构建
• 5.4.2 蛋白小量表达条件摸索
• 5.4.3 模型1蛋白FAD含量测定及扫谱鉴定
• 5.5 本章小结
• 第6章 总结
• 参考文献
• 致谢