白介素-1对单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中ACAT-1的影响及其机制研究

论文摘要

白介素-1对单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中ACAT-1的影响及其机制研究动脉粥样硬化是与多种危险因素包括高血压、糖尿病、吸烟及脂蛋白异常等有关的动脉慢性炎症性疾病。其早期的重要病理改变之一是血液单核细胞在血管内皮细胞功能受损时迁移到内皮下,分化为巨噬细胞,并且摄取大量脂质转变为泡沫细胞,泡沫细胞在血管壁内沉积是动脉粥样硬化早期形成脂质条纹的主要原因。泡沫细胞内脂滴存在的主要脂质是胆固醇酯,它是胆固醇的储存形式,由胆固醇在脂酰CoA胆固醇酯酰转移酶（ACAT）催化下而产生。ACAT是细胞内催化胆固醇酯化的酶,当细胞内胆固醇达到一定量时,ACAT将其酯化储存于细胞内,以避免高浓度的胆固醇对细胞产生毒性作用。但在病理条件下,巨噬细胞内ACAT活性异常升高,促使胆固醇酯大量堆积,对动脉粥样硬化病变早期泡沫细胞的形成起到关键作用,是巨噬细胞摄取脂质过多转变为泡沫细胞的早期事件。因此,ACAT在动脉粥样硬化发生中的作用受到高度重视。ACAT有2种亚型——ACAT-1和ACAT-2,研究表明,与动脉粥样硬化形成有关的为ACAT-1,泡沫细胞形成过程中ACAT-1活性明显上调。但是迄今为止,导致ACAT-1活性上调的机制还不十分清楚,有待于进一步的研究。动脉粥样硬化发生发展过程中,巨噬细胞有各种前炎症细胞因子分泌,如白细胞介素1、6、8（IL-1、IL-6、IL-8）,肿瘤坏死因子-α（TNF-α）,干扰素-γ（INF-γ）等,可促进血管的炎症反应,引起血管平滑肌的增殖及迁移,脂质的堆积,内皮细胞功能的损害。据报道,IL-1、TNF-α均可上调巨噬细胞内ACAT-1的活性,推测巨噬细胞脂质过负荷时IL-1可能就是促发ACAT-1上调的重要启动因素之一,但这一推测有待进一步证实。IL-1是最经典的炎症调节剂,是调节炎症的始动因素。巨噬细胞等可产生IL-1,可在转录水平上调ACAT-1 mRNA的表达,促使胆固醇酯化和沉积,使单核细胞和血管平滑肌细胞向泡沫细胞转化,参与动脉粥样硬化的形成和发展,但作用机制并不明确。已有研究证实,白细胞介素可通过丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）信号通路导致炎症反应;蛋白檄酶C（PKC）可直接磷酸化MAPK上游的原癌基因产物raf-1,从而激活ras介导的MAPK活化。本文拟采用细胞培养及分子生物学技术,对单核/巨噬细胞转变为泡沫细胞过程中进行以下研究:1.IL-1是否是巨噬细胞脂质过负荷后启动ACAT-1上调的始动因子;2.通过测定单核细胞向巨噬细胞分化、巨噬细胞向泡沫细胞分化过程中ACAT-1 mRNA、蛋白表达水平和活性,以明确ACAT-1上调的作用环节;3.IL-1上调ACAT-1的胞内信号转导途径是否依赖于PKC/MAPK信号通路的介导。第一部分IL-1对单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中ACAT-1 mRNA表达的影响目的研究IL-1对单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中ACAT-1 mRNA表达的影响方法1.复苏并培养人单核细胞株THP-1细胞。2.单核细胞株THP-1细胞与乙酸肉豆蔻佛波酯（PMA）共孵育,使之向巨噬细胞诱导分化。倒置显微镜下观察细胞形态学变化,流式细胞术检测诱导后CD14的表达,确定单核细胞已分化为巨噬细胞。3.巨噬细胞与氧化低密度脂蛋白共孵育,使之向泡沫细胞诱导分化。倒置显微镜下观察细胞形态学变化,油红0染色观察细胞质内脂质沉积,确定巨噬细胞已分化为泡沫细胞。4.RT-PCR法检测ACAT-1 mRNA在单核细胞、巨噬细胞、泡沫细胞以及泡沫细胞加IL-1和泡沫细胞加IL-1/IL-1单克隆抗体中的表达。观察IL-1对ACAT-1 mRNA表达的影响,以及IL-1单克隆抗体是否拮抗IL-1对ACAT-1 mRNA的表达。结果1.单核细胞株THP-1细胞复苏后呈悬浮生长、增殖,加入PMA诱导48小时后,细胞形态由圆形变成椭圆形或者不规则形态,为贴壁生长形式,体积明显增大,细胞浆疏松化明显,细胞器增多,细胞膜周围可见突起及伪足形成。PMA诱导后,单核细胞株THP-1细胞可表达CD14,阳性率为87.5%,表明单核细胞分化成为巨噬细胞。2.巨噬细胞经0x-LDL诱导24小时后细胞体积进一步增大,为贴壁生长形式,胞浆疏松。油红0染色胞质内可见红染物质,表明巨噬细胞分化成为泡沫细胞。3.与单核细胞比,巨噬细胞、泡沫细胞以及泡沫细胞加IL-1的ACAT-1mRNA表达均明显增高,尤以泡沫细胞加IL-1中增高明显;与泡沫细胞加IL-1比,泡沫细胞加IL-1/IL-1单克隆抗体的ACAT-1mRNA表达下降。结论1.单核细胞株THP-1经PMA和0x-LDL诱导后,可分化为巨噬细胞、泡沫细胞;此过程中伴随着ACAT-1mRNA表达明显升高。2.IL-1对单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中ACAT-1mRNA的表达有上调作用,IL-1单克隆抗体可以拮抗这种效应;3.IL-1可在转录水平上调ACAT1mRNA表达,促使泡沫细胞的形成,可能是巨噬细胞脂质过负荷后ACAT-1上调的始动因子之一。第二部分IL-1对单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中AGAT-1蛋白表达和酶活性的影响目的探讨IL-1对单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中ACAT-1蛋白表达和酶活性的影响。方法1.复苏并培养人单核细胞株THP-1细胞。2.单核细胞株THP-1细胞与乙酸肉豆蔻佛波酯（PMA）共孵育,使之向巨噬细胞诱导分化。倒置显微镜下观察细胞形态学变化,流式细胞术检测诱导后CD14的表达,确定单核细胞已分化为巨噬细胞。3.巨噬细胞与氧化低密度脂蛋白共孵育,使之向泡沫细胞诱导分化。倒置显微镜下观察细胞形态学变化,油红0染色观察细胞质内脂质沉积,确定巨噬细胞已分化为泡沫细胞。4.Western blot法检测ACAT-1蛋白的表达,液相闪烁计数法检测ACAT-1酶活性。结果1.IL-1可以上调单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中ACAT-1蛋白的表达和酶活性;2.与单核细胞比,巨噬细胞、泡沫细胞以及泡沫细胞加IL-1的ACAT-1蛋白表达均明显增高,尤以泡沫细胞加IL-1中增高明显;3.加入IL-1/IL-1单克隆抗体后单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中ACAT-1蛋白表达和酶活性的上调作用明显降低。结论1在单核细胞转化为泡沫细胞的过程中,无细胞因子干预时,ACAT-1蛋白表达增加和酶活性升高;在IL-1干预时,ACAT-1蛋白表达和酶活性进一步升高;而IL-1单克隆抗体可拮抗这一效应;2.IL-1在单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中通过上调ACAT-1mRNA表达水平来实现ACAT-1蛋白表达及活性上调。第三部分单核细胞向泡沫细胞分化过程中IL-1上调ACAT-1的信号转导机制研究目的研究单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中IL-1是否通过PKC/MAPK信号通路上调ACAT-1。方法1.复苏并培养人单核细胞株THP-1细胞,检测PKC和MAPK的活性。2.单核细胞株THP-1细胞与乙酸肉豆蔻佛波酯（PMA）共孵育,倒置显微镜下观察细胞形态学变化,流式细胞术检测诱导后CD14的表达,检测PKC和MAPK的活性。3.巨噬细胞与氧化低密度脂蛋白共孵育24h,倒置显微镜下观察细胞形态学变化,油红0染色观察细胞质内脂质沉积,检测PKC和MAPK的活性。4.泡沫细胞加IL-1以及泡沫细胞加IL-1/IL-1单克隆抗体后检测PKC和MAPK的活性。5.在单核细胞、巨噬细胞、泡沫细胞、泡沫细胞加IL-1以及泡沫细胞加IL-1/IL-1单克隆抗体后分别加入PKC抑制剂、MAPK抑制剂,分别观察它们对细胞内ACAT-1mRNA和蛋白表达和酶活性的影响。RT-PCR法检测ACAT-1 mRNA的表达,Western blot法检测ACAT-1蛋白的表达,液相闪烁计数法检测ACAT-1酶活性。结果1.与单核细胞比较,巨噬细胞,泡沫细胞及泡沫细胞加IL-1的PKC与MAPK的活性增加;2.加入PKC抑制剂和MAPK抑制剂后,IL-1上调ACAT-1mRNA表达的作用明显降低;3.加入PKC抑制剂和MAPK抑制剂后,IL-1对ACAT-1蛋白表达和酶活性的上调作用明显降低。结论单核细胞诱导分化为泡沫细胞的过程中,IL-1上调ACAT-1mRNA、ACAT-1蛋白表达以及酶活性的作用是通过PKC/MAPK途径实现的。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词
• 第一部分 IL-1对单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中ACAT-1 mRNA表达的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二部分 IL-1对单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中ACAT-1蛋白表达和酶活性的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第三部分 单核细胞向泡沫细胞分化过程中IL-1上调ACAT-1的信号转导机制研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 全文结论
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 主要研究成果和获奖情况