本氏烟与番茄AtTOM类基因克隆与功能初步分析

论文摘要

在病毒侵染植物过程中由于病毒本身只携带少量的基因,其编码的蛋白远不足以完成整个病毒侵染过程,因此必需借助于寄主因子来实现侵染。近年来已在植物中发现一些寄主因子与病毒的复制有关,如拟南芥中的AtTOM1基因与烟草花叶病毒（TMV）的复制相关,三生烟上鉴定的NtTOM1和NtTOM3及本氏烟上鉴定的NbTOM1也与TMV的复制相关。本论文根据已报道的三生烟的NtTOM1和NtTOM3基因序列（AB193039,AB193040）设计特异引物,利用RT-PCR从本氏烟扩增到NbTOM1和NbTOM3的基因片段。序列分析表明,NbTOM1和NbTOM3与三生烟中NtTOM1和NtTOM3的同源性分别为95.9%和98.2%。将NbTOM1和NbTOM3插入到烟草曲茎病毒（TbCSV）卫星分子DNA1的沉默载体中,得到DNA1:TOM1、DNA1:TOM3和DNA1:TOM1-TOM3三个重组质粒,重组质粒利用三亲交配法导入农杆菌,并与中国番茄黄化曲叶病毒（TYLCCNV）共同接种本氏烟。接种14天后半定量PCR分析表明,在接种了DNA1:TOM1的植株中NtTOM1基因被沉默而NtTOM3的mRNA水平未受影响;而接种了DNA1:TOM3的植株中NtTOM3基因被沉默而NtTOM1的mRNA水平未受影响;接种DNA1:TOM1-TOM3的植株,两个基因被同时沉默。沉默植株接种TMV:GFP,GFP观察和Northern blot分析表明,单独沉默NbTOM1或NbTOM3与两者同时沉默的植株中TMV病毒的增殖受抑制。上述结果表明,NbTOM3可能与NbTOM1具有相似的机制支持TMV复制。利用已报道的番茄中AtTOM1类基因序列（AB193041,AB193042,AB193043）设计的特异引物从番茄中扩增了AtTOM1类基因片段（LeTH1,LeTH2,LeTH3）,并将其插入同一TbCSV卫星分子DNA1沉默载体中获得重组质粒DNA1:LeTH1-LeTH2-LeTH3。重组质粒利用三亲交配法导入农杆菌后与TYLCCNV共同接种番茄。接种20天后半定量PCR分析表明,重组质粒与TYLCCNV共同接种番茄后,几个基因可同时被沉默,当沉默后的植株接种TMV:GFP后,GFP观察和Northern blot分析表明TMV复制受抑制。这几个基因分别对TMV复制的影响及是否存在功能冗余还有待进一步的分析。本论文所用的TbCSV DNA1沉默体系,其沉默效率高,接种植物无症状,可以有效地用于快速鉴定基因功能。而利用VIGS体系沉默寄主植物的TOM类因子不失为一种快速获得抗TMV植株的方法。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 一.双生病毒与伴随的小分子DNA
• 1.双生病毒的基因组结构
• 2.双生病毒伴随的卫星DNAβ分子
• 3.双生病毒伴随的DNA1分子
• 3.1 DNA1分子基因组结构
• 3.2 DNA1分子生物学意义
• 二.植物病毒沉默载体
• 1.VIGS的原理
• 2.植物病毒沉默载体发展历程
• 3.病毒载体的优势
• 4.双生病毒沉默载体
• 4.1 双生病毒沉默载体发展现状
• 4.2 双生病毒沉默载体优势
• 5.病毒沉默载体应用前景
• 三.烟草花叶病毒与寄主互作相关研究
• 1.TMV的基因组结构
• 2.TMV复制相关的TOM类宿主因子
• 3 TMV胞间移动中与MP互作的寄主因子
• 4.TMV其它宿主因子
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和载体
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 RNA提取（TRIzol法）
• 2.2.2 RT-PCR
• 2.2.3 割胶回收
• 2.2.4 连接
• 2制备法）'>2.2.5 感受态细胞制备方法（CaCl₂制备法）
• 2.2.6 转化
• 2.2.7 质粒提取
• 2.2.8 酶切分析
• 2.2.9 电击转化土壤根癌杆菌
• 2.2.10 土壤根癌杆菌介导的注射接种
• 2.2.11 土壤根癌杆菌介导的浸润接种
• 2.2.12 CTAB法小量提取基因组DNA
• 2.2.13 半定量RT-PCR分析
• 2.2.14 Northern blot分析
• 第三章 本氏烟中TOM基因的克隆和功能初步分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 植物总RNA的提取
• 3.1.2 RT-PCR扩增TOM类寄主因子
• 3.1.3 序列测定和分析
• 3.1.4 构建沉默克隆
• 3.1.5 接种供试植株
• 3.1.6 TMV:GFP浸润攻毒
• 3.1.7 GFP荧光检测与成像
• 3.1.8 半定量RT-PCR分析
• 3.1.9 Northern blot分析
• 3.2 结果
• 3.2.1 NbTOM1和NbTOM3的克隆及序列分析
• 3.2.2 沉默NbTOM1与NbTOM3基因
• 3.2.3 用TMV:GFP攻毒
• 3.2.4 用半定量RT-PCR分析TOM类基因的mRNA水平
• 3.3 讨论
• 第四章 番茄中TOM类基因的克隆和功能初步分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 植物总RNA的提取
• 4.1.2 设计简并引物及RT-PCR扩增目的片段
• 4.1.3 序列测定和分析
• 4.1.4 沉默载体构建
• 4.1.5 接种供试植株
• 4.1.6 TMV:GFP浸润攻毒
• 4.1.7 GFP荧光检测与成像
• 4.1.8 半定量RT-PCR分析
• 4.1.9 Northern blot分析
• 4.2 结果
• 4.2.1 LeTH1,LeTH2和LeTH3的克隆及序列分析
• 4.2.2 沉默番茄上TOM类基因
• 4.2.3 用TMV:GFP攻毒
• 4.2.4 用半定量RT-PCR分析TOM类基因的mRNA水平
• 4.2.5 用Northern blot分析TMV复制水平
• 4.3 讨论
• 参考文献
• 附录A:常用试剂及仪器
• 附录B:常用缓冲液及培养基配方
• 附录C:英文缩写词表