分子信标用于鼻咽癌细胞中p33～（ING1）和p21 mRNA表达研究

论文摘要

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一,越来越多的研究表明恶性肿瘤发生过程与细胞内相关基因表达水平改变具有密切联系。因此建立快速、准确、灵敏检测基因表达水平的方法,对于肿瘤的早期诊断、发病机理研究和治疗具有重要意义。本论文从分子信标定量检测肿瘤抑制基因mRNA表达水平入手,发展了在基因水平上研究基因间的相互作用和基因表达与细胞药物敏感性关系的体系。第一部分,首先建立高表达p33ING1鼻咽癌HNE1细胞模型,以细胞内一种重要的肿瘤抑制基因——p21的序列设计分子信标,发展了基于分子信标直接在总RNA中定量检测靶mRNA的方法。利用建立的p21/cDNA标准曲线,初步考察了肿瘤抑制基因p33ING1转染和化疗药物5-氟尿嘧啶（5-FU）处理对于p21mRNA表达水平的影响。结果显示基因转染和5-FU处理都能诱导p21mRNA表达水平的上调,利用p21分子信标检测的样品中p21mRNA拷贝数在1.92×109至8.30×1010/μg总RNA之间。该方法快速、准确、成本低的优点有望用于肿瘤相关基因的定量检测和对各种药物的疗效评价。第二部分,在上一章建立的分子信标定量检测mRNA的方法基础上,考察了鼻咽癌HNE1细胞p33ING1转染前后该基因mRNA表达水平的变化,结合传统分子生物学方法研究该基因转录水平变化对细胞增殖的影响及可能机制,并从蛋白质水平验证分子信标快速检测mRNA方法的可靠性和实用性。结果表明:p33ING1基因能通过增强p53信号通路相关蛋白表达和抑制STAT3信号通路蛋白的表达水平两种途径来实现抑制细胞增殖。第三部分,本研究利用分子信标定量检测mRNA的方法,系统考察了5-FU作用浓度和时间对不同鼻咽癌细胞系中p33ING1mRNA表达水平的影响。并通过传统分子生物学手段,考察了p33ING1基因高表达的细胞对于5-FU的敏感程度和产生的分子机制。发现增加药物浓度和延长作用时间都能诱导p33ING1 mRNA水平上调,并且其上调程度与初始p33ING1基因表达水平相关,表达高的细胞中这种诱导作用更明显。MTT结果表明p33ING1基因表达水平上调能增强鼻咽癌细胞对5-FU敏感性。表明该方法可望为肿瘤的个体化治疗提供快速、准确、合理用药提供参考依据。

论文目录

摘要

Abstract

本文所用英文缩写词表

第1章绪论

1.1 检测m RNA 的常用方法

1.1.1 RT-PCR 方法

1.1.2 实时荧光定量 PCR 方法

1.1.3 传统核酸探针法

1.1.4 基因芯片方法

1.2 分子信标在核酸研究的应用

1.2.1 分子信标设计和作用原理

1.2.2 PCR 分子信标法测定靶DNA/RNA 的浓度

1.2.3 利用多色分子信标分析基因突变、SNP、多组分同时测定

1.2.4 痕量DNA/m RNA 的分离和检测

1.2.5 活体细胞内mRNA 表达的实时监测

1.2.6 DNA 转录过程的体外实时监测

1.2.7 核酸磷酸化的实时监测

1.2.8 DNA 传感器和生物芯片

1.3 本文拟开展的工作

第2章分子信标快速检测p21m RNA 的方法

2.1 前言

2.2 实验部分

2.2.1 分子信标检测mRNA 表达水平的实验原理

2.2.2 试剂和仪器

2.2.3 实验方法

2.3 结果与讨论

ING1高表达的HNE1 细胞系模型的建立和鉴定'>2.3.1 p33^ING1高表达的HNE1 细胞系模型的建立和鉴定

2.3.2 建立p21 分子信标/cDNA 标准曲线

2.3.3 考察各种因素对于mRNA/p21 分子信标杂交影响

2.3.4 p21 分子信标定量检测鼻咽癌细胞中p21 m RNA 水平

2.3.5 RT-PCR 验证p21 信标检测方法的准确性

2.4 小结

ING1高表达对人鼻咽癌细胞增殖的影响研究'>第3章 p33^ING1高表达对人鼻咽癌细胞增殖的影响研究

3.1 前言

3.2 实验部分

3.2.1 试剂和仪器

3.2.2 实验方法

3.3 结果与讨论

ING1高表达的抑制HNE1 细胞的生长'>3.3.1 p33^ING1高表达的抑制HNE1 细胞的生长

ING1 mRNA 的表达水平'>3.3.2 应用分子信标检测细胞中p33^ING1 mRNA 的表达水平

3.3.3 免疫组化实验方法确定细胞中p53 蛋白的分布情况

ING1 mRNA 表达成像'>3.3.4 分子信标用于固定化细胞中p33^ING1 mRNA 表达成像

ING1高表达促使细胞周期停滞于G₁ 期'>3.3.5 p33^ING1高表达促使细胞周期停滞于G₁期

ING1高表达促进细胞周期相关蛋白表达水平上调'>3.3.6 p33^ING1高表达促进细胞周期相关蛋白表达水平上调

ING1高表达抑制细胞的侵袭转移能力'>3.3.7 p33^ING1高表达抑制细胞的侵袭转移能力

3.4 小结

ING1高表达增强鼻咽癌HNE1 细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性'>第4章 p33^ING1高表达增强鼻咽癌HNE1 细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性

4.1 前言

4.2 实验部分

4.2.1 试剂和仪器

4.2.2 实验方法

4.3 结果与讨论

ING1 mRNA 的表达水平与5-FU 处理浓度和时间成正相关性．．'>4.3.1 p33^ING1 mRNA 的表达水平与5-FU 处理浓度和时间成正相关性．．

ING1高表达增强细胞对5-FU 敏感性'>4.3.2 p33^ING1高表达增强细胞对5-FU 敏感性

ING1高表达促进5-FU 诱导的细胞凋亡'>4.3.3 p33^ING1高表达促进5-FU 诱导的细胞凋亡

ING1高表达促进抑癌蛋白表达水平并抑制原癌蛋白表达水平'>4.3.4 p33^ING1高表达促进抑癌蛋白表达水平并抑制原癌蛋白表达水平

4.4 小结

结论

参考文献

致谢

附录攻读学位期间所发表的学术论文目录

分子信标用于鼻咽癌细胞中p33～（ING1）和p21 mRNA表达研究

论文摘要

论文目录

相关论文文献

猜你喜欢