草鱼肌肉生长抑制素基因克隆及功能研究

论文摘要

基因功能和转基因是鱼类育种领域重要的研究方向。通过对主效基因的研究，选育生长性状优良的个体从而建立良种，对大型鱼类的选育有着较为明显的实际意义。草鱼（Ctenopharyngodon idellus）是我国特有的经济鱼类，长期以来一直是最重要的养殖鱼类之一。但草鱼成体较大，且生长周期较长，在华东地区需5-6年，选育4代需要20-24年甚至需要更长，采用传统方法很难在短期内培育出优良品种。肌肉生长抑制素（myostatin或MSTN）属于转化生长因子TGF-β超家族成员，从1997年首次被发现以来一直被认为是一种有效的肌肉生长负调控因子。肌肉生长抑制素拥有TGF-β超家族共有的标志性结构，即前部一个信号肽、一个N端前肽和C端活性成熟肽组成的结构域，其中羧基末端区域包含9个保守的半胱氨酸残基，及一个RXXR蛋白酶水解位点。目前的研究表明在哺乳动物和鸟类中只存在一个myostatin基因，与之不同的是一些鱼类中发现两个重复myostatin基因，即myostatin-1和myostatin-2基因；甚至在鲤鱼中发现了4个重复myostatin基因。此外，与哺乳动物中主要在骨骼肌中表达不同，在鱼类成体各组织中均能检测到其表达。这表明myostatin基因除了和在哺乳动物中一样参与肌肉生长和发育的调控外，可能还与其他功能有关。本研究通过RACE方法，首次获得了草鱼myostatin-1基因的cDNA全长序列，草鱼myostatin-1基因全长分别为2200bp，其中开放阅读框为1128bp。与斑马鱼myostatin-1一样，草鱼myostatin-1成熟肽有两个TGF-β蛋白结构域，C端具有9个保守的半胱氨酸残基和RIRR的蛋白酶水解位点。序列比对结果显示，草鱼myostatin-1与斑马鱼myostatin-1的相似度高达96%，显示了较强的进化保守性。不同胚胎时期的RT-PCR分析结果表明，该基因在不同的发育时期具有不同的表达情况，即胚胎发育早期表达量较低，36hpf表达量明显升高，这可能与该时期的体节分化有关。整胚原位杂交结果显示，草鱼myostatin-1 mRNA主要在脊索和脑中表达，但随胚胎的发育其表达情况有一定的迁移。而在草鱼成体不同组织中，myostatin-1在肌肉、脑和眼中的表达量最高，肝胰脏、脾脏和心脏表达量其次，而在其他组织中并无表达。通过显微注射提高该基因的表达量会导致胚胎发育异常。主要表现为在体节发生期体轴变长，体高降低，形成纺锤形，包被层萎缩；并导致过高的畸形率和死亡率，其表现与肌肉萎缩症较为相似。进一步的整胚原位杂交实验结果显示myostatin-1基因过表达会导致下游基因如：MyoD和ntl等基因的异常表达，从而导致胚胎发育的异常。本实验结果表明草鱼myostatin-1基因除了肌细胞分化和增生起到重要的负向调控作用之外还与脊椎形成和神经系统的发育有密切的联系；这些结果不仅提供在鱼类中的特殊功能的新线索，并且还揭示肌肉生长抑制素在脊椎动物中轴和脊索形成和发育过程中的不可替代的作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一章 草鱼myostatin-1 基因的克隆与表达研究
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验鱼和胚胎
• 1.1.2 主要试剂及常用溶液、培养基及缓冲液的配制
• 1.1.3 仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 总RNA 提取
• 1.2.2 cDNA 全长克隆
• 1.2.3 核苷酸序列测定及分析
• 1.2.4 RT-PCR 分析
• 1.2.5 整胚原位杂交
• 1.3 结果
• 1.3.1 草鱼myostatin-1 基因的克隆及序列分析
• 1.3.2 同源比较
• 1.3.3 草鱼MSTN-1 mRNA 在草鱼胚胎表达
• 1.3.4 草鱼MSTN-1 mRNA 在草鱼组织中表达
• 1.4 讨论
• 第二章 草鱼myostatin-1 基因在胚胎中的过表达研究
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验鱼
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 PCR 扩增
• 2.2.3 重组质粒的酶切鉴定
• 2.2.4 5’加帽mRNA 的制备
• 2.2.5 草鱼和斑马鱼胚胎显微注射
• 2.2.6 整胚原位杂交标探针制备
• 2.2.7 整胚原位杂
• 2.3 结果
• 2.3.1 草鱼的MSTN-1 过表达载体的构建和体外5’加帽mRNA 合成
• 2.3.2 MSTN-1 mRNA 过表达对草鱼和斑马鱼胚胎发育的影响
• 2.3.3 在斑马鱼胚胎中MSTN-1 mRNA 过表达对下游基因的影响
• 2.4 讨论
• 结论与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢