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脑血管痉挛中缝隙连接蛋白Cx43、Cx40磷酸化水平及其磷酸化位点分析

2020-12-11阅读(441)

脑血管痉挛中缝隙连接蛋白Cx43、Cx40磷酸化水平及其磷酸化位点分析

论文摘要

目的：心脑血管系统中主要表达和起作用的缝隙连接蛋白为Cx43和Cx40，其磷酸化在许多心脑血管疾病中扮演着重要角色。本实验在前期研究的基础上，分析脑血管痉挛中缝隙连接蛋白Cx43、Cx40的磷酸化水平并利用质谱技术筛选出其磷酸化位点。为更深入研究缝隙连接蛋白Cx43、Cx40磷酸化参与蛛网膜下腔出血（SAH）后脑血管痉挛（CVS）的机制奠定坚实的基础，并为下一步筛选出对CVS有效药物提供靶点。方法：1、ET-1诱导的SD大鼠脑基底动脉血管条CVS模型的建立：采用同种系SD大鼠，麻醉后断头取脑，显微镜下分离脑基底动脉，将其剪成完整的动脉条，400pmol ET-1孵育动脉条，建成ET-1诱导的SD大鼠脑基底动脉血管条CVS模型。2、CVS模型的检测：分为ET-1刺激组和正常组，比对ET-1刺激后血管条发生的张力变化。3、CVS组和正常组中Cx43、Cx40磷酸化水平的分析：利用磷酸化蛋白富集试剂盒富集CVS组和正常组中的磷酸化总蛋白，再利用Western Blotting技术分析CVS组和正常组中Cx43、Cx40磷酸化水平的改变。4、CVS中Cx43、Cx40磷酸化位点的检测：利用串联质谱技术对CVS中Cx43、Cx40磷酸化位点进行分析，筛选出CVS中Cx43、Cx40发生磷酸化的位点。结果：1、成功建立ET-1诱导的SD大鼠脑基底动脉血管条CVS模型，血管条张力检测发现，ET-1刺激后血管条张力发生明显的改变。2、正常脑基底动脉中Cx43、Cx40都处于相对较低的磷酸化水平，但与Cx43相比，Cx40处于相对较高的的磷酸化水平。3、CVS后Cx43、Cx40磷酸化水平明显升高，然而比较Cx43、Cx40磷酸化蛋白表达量发现CVS中磷酸化GJ蛋白的表达主要以Cx40为主。4、前期我们研究表明正常脑基底动脉平滑肌层的GJ蛋白主要为Cx40,CVS后则以Cx43的表达为主，结合本实验结果我们发现：CVS后脑基底动脉平滑肌中总蛋白的表达主要为Cx43，而磷酸化蛋白的表达则以Cx40为主。5、对CVS中Cx43与Cx40进行磷酸化位点检测，分别筛选出Cx40的9个磷酸化位点和Cx43的4个磷酸化位点。结论：CVS后这种总蛋白与磷酸化蛋白表达的不一致可能在CVS的病理过程中起到重要作用。并且筛选出来的Cx40的9个磷酸化位点和Cx43的4个磷酸化位点可能是导致CVS后GJ功能发生改变的关键，并由此影响到CVS的发生与发展。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第1章 引言
  • 第2章 材料与仪器
  • 2.1 实验动物
  • 2.2 实验试剂
  • 2.2.1 主要购置试剂
  • 2.2.2 主要配置试剂
  • 2.3 实验仪器
  • 第3章 方法
  • 3.1 实验思路
  • 3.1.1 正常脑血管壁 Cx43、Cx40 的磷酸化水平
  • 3.1.2 CVS 中 Cx43、Cx40 的磷酸化水平
  • 3.1.3 CVS 中 Cx43、Cx40 的磷酸化位点
  • 3.2 实验分组
  • 3.3 ET-1 诱导的 SD 大鼠脑基底动脉血管条ＣＶＳ模型的建立
  • 3.4 脑基底动脉血管条张力检测
  • 3.4.1 实验系统连接和仪器参数设置
  • 3.4.2 实验步骤
  • 3.5 Western blotting技术检测正常组与CVS组中Cx43 与 Cx40磷酸化水平8
  • 3.5.1 正常组与 CVS 组磷酸化总蛋白样品制备
  • 3.5.2 样品蛋白含量的测定
  • 3.5.3 配胶
  • 3.5.4 灌胶和上样
  • 3.5.5 垂直电泳
  • 3.5.6 转膜
  • 3.5.7 样品蛋白免疫反应
  • 3.5.8 样品蛋白化学发光及曝光
  • 3.5.9 膜再生
  • 3.5.10 内参蛋白免疫反应
  • 3.5.11 内参蛋白蛋白化学发光及曝光
  • 3.5.12 图像分析
  • 3.5.13 数据统计分析
  • 3.6 CVS 中 Cx43、Cx40 磷酸化位点质谱鉴定
  • 3.6.1 磷酸化 Cx43、Cx40 SDS 胶条的获取
  • 3.6.2 SDS 胶内酶切
  • 3.6.3 质谱鉴定 Cx43、Cx40 磷酸化位点
  • 3.6.4 数据库检索
  • 第4章 实验结果
  • 4.1 体外脑基底动脉血管条 CVS 模型的成功建立
  • 4.2 正常组与 CVS 组中 Cx43、Cx40 蛋白磷酸化水平变化
  • 4.3 质谱鉴定 Cx43、Cx40 磷酸化位点结果
  • 第5章 讨论
  • 5.1 蛛网膜下腔出血（SAH）后脑血管痉挛（CVS）一般概况
  • 5.2 缝隙连接（GJ）
  • 5.3 GJ 蛋白 Cx43、Cx40 磷酸化及其对 GJ 功能的影响
  • 5.4 Cx43、Cx40 磷酸化在 CVS 中作用的研究
  • 5.5 展望
  • 第6章 结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附图
  • 攻读学位期间的研究成果
  • 综述
  • 参考文献

    • 相关论文文献

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