星星草2型金属硫蛋白（PutMT2）在酵母中的表达及金属结合特性分析

论文摘要

金属硫蛋白（metallothionein, MTs）是自然界中普遍存在的一类低分子量、高Cys含量、具有金属结合能力的蛋白质。植物MTs被认为在解除重金属离子的毒害、维持组织中金属离子的平衡、调节金属离子向特定组织的运输及ROS的清除等方面起作用,与植物的抗逆反应有关,可增强植物对逆境的耐受性。通过将星星草酵母cDNA文库在NaCl胁迫培养基中筛选,得到了抗盐性较强的的克隆,分类得到2型金属硫蛋白基因PutMT2（GenBank Accession No. JQ279061）,该基因开放阅读框（ORF）为246bp,编码81个氨基酸。通过生物信息学分析其分子量约8kDa,理论等电点为5.66,中间区具有丝氨酸与苏氨酸的磷酸化位点,不规则卷曲是其蛋白质二级结构的主要结构元件。PutMT2基因在酵母中表达提高了酵母对Cd2+、Zn2+、Cr6+、Ag+、Fe2+、Fe3+各金属离子及对NaCl、H2O2的抗性,使酵母对Mn2+、Co2+、Cu2+、Ni2+等离子敏感。以Na、Zn、Cu、Fe为代表,通过原子吸收法分别测定比较转空载体和PutMT2酵母细胞金属积累量与蛋白结合金属量的差别。结果表明,PutMT2在一定条件下可结合Na+,其表达使酵母细胞内Na含量降低。PutMT2蛋白可结合Zn2+,在低浓度Zn时促进酵母细胞内Zn积累,在胁迫浓度时降低酵母细胞内Zn含量。PutMT2的表达降低了细胞内铜含量,PutMT2结合Cu的功能可能会影响细胞内的Cu离子平衡,使转基因酵母表现出对Cu2+的敏感性。PutMT2可通过结合Fe来提高转基因酵母的抗性。利用大肠杆菌BL21表达体系高效表达并得到大量纯化GST-PutMT2融合蛋白。此融合蛋白较易纯化,锌、铜、钠离子的添加不影响蛋白的纯度,且在添加适当离子浓度时会增加纯化蛋白的产量。通过ICP-AES测定GST蛋白与GST-PutMT2融合蛋白中结合的金属元素种类与含量,发现PutMT2蛋白对Cr、Cd、Co、Ag, Ba、Pb、Mn、Zn、Fe、Cu、P、Al、Mg等金属都表现出结合性质,对Ni、As的作用不明显,未发现PutMT2具有选择性特异结合倾向的金属离子。PutMT2蛋白对Cu、Zn、Fe结合量并不随添加金属离子增加而直增大,表现出离子调节的作用。在正常培养条件下,PutMT2可结合Na,而在其他金属离子如Cu、Zn、Fe等含量增加后,对Na不再有结合作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 课题背景（或引言）
• 1.2 植物金属硫蛋白研究进展
• 1.2.1 植物MTs的分类
• 1.2.2 植物MTs基因的表达调控
• 1.2.3 植物MTs蛋白的结构
• 1.2.4 植物MTs的功能
• 1.3 研究的目的与意义
• 2 星星草PutMT2基因的克隆与生物信息学分析
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 星星草cDNA酵母9.3文库NaCl胁迫筛选
• 2.2.2 酵母总DNA的提取
• 2.2.3 PCR产物的片段回收与连接
• 2.2.4 大肠杆菌转化
• 2.2.5 质粒提取
• 2.2.6 星星草PutMT2的序列分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 PutMT2基因的克隆与序列分析
• 2.3.2 PutMT2蛋白同源性与进化树分析
• 2.3.3 PutMT2蛋白性质预测
• 2.3.4 PutMT2蛋白磷酸化位点预测分析
• 2.3.5 PutMT2蛋白的二级结构预测
• 2.4 本章小结
• 3 PutMT2在酵母中的表达及金属结合特性分析
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 酵母表达载体pAUR123-PutMT2的构建
• 3.2.2 质粒pAUR123-PutMT2酵母转化
• 3.2.3 酵母的抗性分析
• 3.2.4 原子吸收测定酵母细胞金属累积量和总蛋白络合金属量
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 pAUR123-PutMT2表达载体的构建与探针标记
• 3.3.2 表达PutMT2酵母胁迫逆境响应分析
• 3.3.3 原子吸收法测定分析表达PutMT2酵母金属结合能力
• 3.4 本章小结
• 4 PutMT2在大肠杆菌中的表达及金属结合能力分析
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 实验菌株和仪器
• 4.1.2 实验试剂及配方
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 GST-PutMT2表达载体的构建
• 4.2.2 SDS-PAGE电泳
• 4.2.3 GST-PutMT2融合蛋白的小量诱导
• 4.2.4 GST-PutMT2融合蛋白的大量诱导
• 4.2.5 GST-PutMT2融合蛋白的纯化
• 4.2.6 不同金属离子对GST-PutMT2融合蛋白产量的影响
• 4.2.7 ICP-AES测定分析PutMT2的金属结合能力
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 GST-PutMT2表达载体的构建与鉴定
• 4.3.2 GST-PutMT2融合蛋白的诱导表达
• 4.3.3 GST-PutMT2融合蛋白的纯化
• 4.3.4 金属离子对GST-PutMT2蛋白产量的影响
• 4.3.5 ICP-AES蛋白样品的纯化与定量
• 4.3.6 PutMT2蛋白金属结合特性分析
• 4.4 本章小结
• 结论
• 讨论和展望
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢