论文摘要
心脏发育是一个及其复杂过程,受到一系列心脏发育基因的精确调控。这些基因的突变或异常表达将对心脏细胞的分化、心脏细胞的多样性以及心脏细胞不同形态发生产生影响,从而导致胚胎死亡或者各种心脏病。近年来尽管对于心脏病发生的研究已取得进展,但其致病机制仍有待阐明。Pygo1基因是我们实验室克隆的心脏发育候选基因,通过在细胞系中的研究发现,Pygo1可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路在心脏发育过程中起着重要的调控作用。本文利用生物信息学选择斑马鱼Pygo1基因亲水抗原区,将扩增出的PCR片段克隆到原核表达pGEMT-4T-1载体中,转入E.coli中后通过IPTG诱导表达GST融合蛋白。蛋白经纯化分离后用于免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。经Western blot检测表明,Pygo1蛋白在成体斑马鱼的脑、心脏、肌肉和鳃中表达,而在斑马鱼胚胎发育二细胞期Pygo1蛋白开始表达。在斑马鱼中沉默Pygo1基因后,一些转录因子如GATA4、Nkx2.5、dHand蛋白的表达下调,说明该基因可能有心脏早期发育相关。一些左右不对称基因如Nodal、Lefty1、Pitx2的蛋白也会在沉默了Pygo1基因的斑马鱼中表达下调,这说明Pygo1基因可能与心脏的左右发育不对称相关。本实验室克隆了人类心脏发育候选基因Nulp1,已有研究发现Nulp1可能通过与FHL2相互作用与Wnt信号通路相联系。在细胞系中的研究发现,Nulp1基因可能抑制Wnt/β-catenin信号通路。本文通过Western blot实验发现在斑马鱼沉默Nulp1基因后,一些转录因子如GATA4、Nkx2.5的蛋白表达将受影响上调。通过构建Nulp1与FHL2的缺失突变表达载体,转染细胞后进行免疫共沉淀实验,结果表明只有Nulp1的bHLH结构域的碱性区域与FHL2发生相互作用,而FHL2只要存在LIM1结构域就能与Nulp1相互作用。总之,上述研究进一步证明Pygo1与Nulp1在心脏发育中具有重要功能,研究清楚其作用的分子机制将为阐明心脏发育和心脏病发生的机制奠定基础。
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相关论文文献
- [1].果蝇nulp1特异性多克隆抗体制备及检测[J]. 湖南师范大学自然科学学报 2011(04)
- [2].小鼠nulp1基因多克隆抗血清的制备及检测[J]. 怀化学院学报 2014(05)
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