论文摘要
背景胸腺是T细胞发育最适宜的微环境。T细胞在胸腺内发育成熟需要经历严格的阳性选择和阴性选择。胸腺细胞的阴性选择不仅需要胸腺细胞的TCR信号，还需要胸腺细胞与抗原递呈细胞（antigen presenting cell，APC）表面结合提供第二信号（自身肽-MHC分子）的共刺激分子。共刺激信号在阴性选择中发挥必要的作用。共刺激信号可以增强也可以终止免疫应答，即也具有免疫调整作用。已证实B7-1（CD80）与CD28是最基本的共刺激分子。胸腺内B7-1主要表达于树突状细胞（dendritic cell，DC）、巨噬细胞和某些网状上皮细胞（epithelioreticlar cells，ERC）上。依据分布和功能广义的胸腺上皮细胞可分为6型，其中包含有狭义的网状上皮细胞和树突状细胞（又名为交错突细胞），皆可表达CD80。现今认为DC是功能最强大的抗原递呈细胞（antigen presenting cell，APC），它呈递抗原的能力是巨噬细胞的100-1000倍。癌胚抗原（carinoembryonic antigen，CEA）是一种分子量约为180 kDa的糖蛋白分子，胚胎时期的正常表达分泌，对胚胎的发育、组织形成具有重要的作用。临床上，CEA已用于相关肿瘤的检测和治疗。关于胸腺细胞发育成熟的规律和胸腺基质细胞对其调节作用及分子机制研究等，多是以动物胸腺为研究对象。目前关于CDSO及CEA分子在胎儿胸腺的表达定位的研究国内外尚未见报道。本研究应用胎儿胸腺组织冰冻切片的HE染色、ANAE（α-naphthyl acidic esterase，α-萘酚酸性酯酶）组化染色、CD80和CEA免疫组化染色，并用Trizol法提取胎儿胸腺蛋白质，以Western blotting和ELISA技术分别对早期、晚期胎儿胸腺观察了早期、晚期胎儿的CD80和CEA免疫反应性（immunoreactivity，IR）的表达和分布情况。材料与方法1．取孕妇自愿提供的意外怀孕、水囊引产的胎儿12例，包含早期胎儿胸腺3-4个月的4例（Ⅰ组）和晚期胎儿胸腺的5-8个月的8例（Ⅱ组）。2．将标本等分为两份，一份制备冰冻组织切片，进行常规HE染色、ANAE组织化学染色、CDSO和CEA免疫组织化学染色，油镜下各观察其信号定位。3．另一份标本以Trizol提取蛋白质进行Western blotting和CEA-ELISA检测，用Shimadu薄层层析扫描仪扫描CD80及β-actin条带的OD值，计算早期胎儿胸腺和晚期胎儿胸腺的CD80／β-actin的比值；用酶标仪检测两组胎儿胸腺CEA含量的OD值。3．应用SPSS 10.0软件，进行ANOVA统计学分析，以α=0.05检测两组间差异显著性。结果1 HE染色早期胎儿胸腺体积较小，皮质和髓质发育差，髓质网孔空隙较小。晚期胎儿胸腺体积较大，皮质和髓质逐渐发育，髓质的网孔空隙较大。晚期标本胸腺髓质内可见典型的哈氏小体（Hassall’s corpuscle）。2 CD80免疫组化染色CDSO免疫反应性（immunoreactivity，IR）CD80-IR呈棕色细颗粒，广义的网状上皮细胞（epithelioreticfar cells，ERC）均呈CD80阳性反应。早期胎儿胸腺CD80-IR细胞不显著；晚期胎儿胸腺CD80-IR细胞明显增多，且髓质内显著多于皮质。ERC可分为6型：①Ⅰ型ERC：定位于皮质，网状上皮细胞呈扁平状，位于被膜和小梁的内面；②Ⅱ型ERC：分布于皮质内，细胞呈小星形，突起也很少；③Ⅲ型及Ⅳ型ERC：呈扁平状，定位于皮质髓质交界处；④Ⅴ型ERC：分布于髓质内，细胞呈大星形状，突起多且细长；⑤Ⅵ型ERC：位于髓质内哈氏小体。3 ANAE染色已知ANAE组化染色可标记T淋巴细胞及其亚型。胸腺成熟T细胞可分为点样型（代表CD4+）和散粒型（代表CD8+）。点样型细胞内可见1-3个边界清楚的深红色小点。散粒型细胞内呈多数弥散小颗粒。早期胎儿胸腺标本ANAE标记细胞不明显；晚期胎儿胸腺髓质内ANAE染色的CD4+或CD8+细胞各呈丛状分布。胎儿胸腺髓质内哈氏小体及巨噬细胞ANAE染色呈强阳性的火焰型。4．CEA免疫组化染色早期胎儿胸腺内CEA免疫反应阳性定位于髓质网状上皮细胞和哈氏小体。晚期胎儿胸腺髓质内CEA免疫反应阳性更强，多集中于哈氏小体。5 Western Blotting早期胎儿胸腺CD80与β-actin的OD比值为0.66±0.09。晚期胎儿胸腺CD80与β-actin的OD比值为0.89±0.11。两组相比较，差异具有显者性，p＜0.05。6．ELISA法检测CEA早期胎儿胸腺蛋白提取液中CEA含量的OD值为0.181±0.03，晚期胎儿胸腺蛋白提取液中CEA含量的OD值为0.302±0.04，两组相比较，差异具有显著性，p＜0.05。结论1．晚期胎儿胸腺标本的CD80免疫印迹和CEA-ELISA的检测值均显著高于早期胎儿。这表明晚期胎儿胸腺的CD80及CEA表达水平显著高于早期胎儿的胸腺。2．早期胎儿胸腺发育差。晚期胎儿胸腺内CD80免疫反应性细胞依据分布可分为6型，其中Ⅰ型ERC，Ⅲ型及Ⅳ型ERC均具有隔离屏障作用。皮质内Ⅱ型ERC和位于髓质内Ⅴ型ERC皆为狭义的DC。Ⅵ型ERC定位于哈氏小体。这提示胸腺微环境又可分隔为若干亚微环境。3．早期组CEA阳性分布于髓质上皮细胞和哈氏小体，晚期组CEA阳性更集中于哈氏小体。哈氏小体的CEA-IR结合CD80-IR以及ANAE强阳性染色，这提示哈氏小体可具有一定的生物学功能。4．晚期胎儿胸腺的髓质内ANAE的点样型（代表CD4+）或散粒型（代表CD8+）各呈丛状分布，提示其各位于不同网孔的亚微环境内。