氨基酸类阳离子脂质体的合成及其基因转染效率评价

论文摘要

基因治疗在肿瘤治疗和遗传病治疗方面有很好的前景,引起了广泛关注。基因治疗面临的最主要的难题是寻找一种高效、低毒的基因转染载体,将基因药物导入特定的细胞中,并能稳定地维持其功能。目前,基因载体一般分为病毒载体和非病毒载体。而阳离子脂质体是非病毒载体中最有潜力的基因载体之一本论文以氨基酸为原料,经月桂醇或正辛醇的酯化反应、氯乙酰氯酰胺化反应和季铵化反应,合成了一系列包括Glu-C12、TMA-C2-Glu-C12、TMA-C2-Glu-C8、TMA-C2-β-Ala-C12.TMA-C2-Val-C12、TMA-C2-Met-C12、TMA-C2-Gly-C12和TMA-C2-Asp-C12在内的八种氨基酸类阳离子脂质。采用超声波分散技术,用二次蒸馏水将自合成的阳离子脂质分散成阳离子脂质体,再将脂质体与EGFP质粒混合制备成脂质体/EGFP质粒复合物。用Zetasizer Nano ZS激光粒度仪测定了各阳离子脂质体和脂质体/EGFP质粒复合物的平均粒径、粒径分布和zeta电位。调节复合物的N/P比,使zeta电位与平均粒径等物理结构参数满足最佳的细胞转染条件以制备的各种阳离子脂质体为基因载体,装载EGFP质粒,对HEK293细胞进行体外细胞转染实验,并采用商用转染试剂LipofectamineTM2000（Lipo2000）进行阳性对照。实验结果表明,由β-丙氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸和甘氨酸制备的含单一疏水长链的阳离子脂质体TMA-C2-β-Ala-C12、TMA-C2-Val-C12、TMA-C2-Met-C12、TMA-C2-Gly-C12,不论任何N/P比都没有转染效率。而含双疏水长链的阳离子脂质体却具有较好的转染效率,且谷氨酸型阳离子脂质体TMA-C2-Glu-C12的转染效率高于天冬氨酸型阳离子脂质体TMA-C2-Asp-C12。但是,疏水链长度为8个碳原子的脂质体TMA-C2-Glu-C8和不含季铵盐头基及连接臂的脂质体Glu-C12没有转染效率。以脂质体TMA-C2-Glu-C12为基因载体,装载EGFP质粒,对HEK293、HBL100、293FT、A549、GC-1、Ges-1、HT1080、HUVEC、U251、3T3-L1、SW-480、NIH3T3、HeLa、MCF-7和Hct116十五种细胞系进行转染。用MTT法检测该脂质体的细胞毒性。实验结果表明,脂质体TMA-C2-Glu-C12能适用于大多数细胞系,且转染效率与Lipo2000相当,甚至优于Lipo2000,是一种广谱、高效和低毒的基因转运载体。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 基因治疗简介
• 1.2 基因治疗载体简介
• 1.3 阳离子脂质类载体
• 1.3.1 阳离子头基的调控
• 1.3.2 疏水性尾部的调控
• 1.3.3 连接臂的调控
• 1.4 论文的研究思路和主要内容
• 第二章 氨基酸类阳离子脂质的设计与合成
• 2.1 阳离子脂质分子的设计
• 2.2 试剂与仪器
• 2.2.1 实验试剂
• 2.2.2 实验仪器
• 2.3 实验内容
• 2.3.1 L-谷氨酸类阳离子脂质的合成
• 2.3.2 L-谷氨酸类阳离子脂质的合成
• 2.3.3 β-丙氨酸类阳离子脂质的合成
• 2.3.4 L-缬氨酸类阳离子脂质的合成
• 2.3.5 L-甲硫氨酸类阳离子脂质的合成
• 2.3.6 甘氨酸类阳离子脂质的合成
• 2.3.7 L-天冬氨酸类阳离子脂质的合成
• 2.4 结果与讨论
• 第三章 阳离子脂质体纳米粒子、脂质体/DNA复合物的制备及其性能测试
• 3.1 试剂与仪器
• 3.2 实验内容
• 3.2.1 阳离子脂质体纳米粒子的制备
• 3.2.2 脂质体/DNA复合物的制备
• 3.2.3 阳离子脂质体纳米粒子的粒径和表面电位测定
• 3.2.4 脂质体/DNA复合物的粒径和表面电位测定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 阳离子脂质体纳米粒子的制备
• 3.3.2 脂质体/DNA复合物的制备
• 3.3.3 阳离子脂质体纳米粒子的粒径和表面电位测定
• 3.3.4 脂质体/DNA复合物的粒径和表面电位测定
• 第四章 氨基酸类阳离子脂质体/DNA复合物的体外基因转染与毒性研究
• 4.1 主要试剂与仪器
• 4.2 实验内容
• 4.2.1 细胞的培养
• 4.2.2 体外细胞转染
• 4.2.3 阳离子脂质体的细胞毒性实验
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 体外细胞实验
• 4.3.2 细胞毒性实验
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 附录一
• 附录二
• 致谢