论文摘要
目的1、通过黄曲霉毒素B1（AFB1）处理肝癌细胞株SMMC-7721研究AFB1对SMMC-7721细胞生长的影响2、探讨黄曲霉菌毒素B1是否激活肝癌细胞株SMMC-7721细胞内的Ras-ERK信号转导通路3、叶绿酸对黄曲霉毒素B1是否具有抑制作用。方法1、首先应用不同浓度的黄曲霉毒素B120ug/ml、10ug/ml、5ug/ml、2ug/ml、1.0ug/ml、0.1ug/ml、0.01ug/ml处理肝癌细胞株SMMC-7721,MTT法绘制细胞生长曲线,观察黄曲霉毒素B1对肝癌细胞株SMMC-7721细胞生长的影响。选择AFB11.0ug/ml作为本实验的最佳实验浓度作进一步实验。2、观察AFB11.0ug/ml对肝癌细胞株SMMC-7721细胞周期的影响,应用AFB11.0ug/ml处理SMCC-7721细胞,37.0℃、5%CO2培养箱培养24小时后收集细胞进行流式细胞术检测。3、观察AFB1是否能够快速激活SMMC-7721细胞内Ras-MAPK信号转导途径,应用AFB11.0ug/ml处理SMMC-7721细胞,37.0℃、5%CO2条件下培养,分别于处理后0、30、60、90、120分钟收集细胞并提取细胞蛋白质,选择Ras、ERK1蛋白作为指标应用免疫印迹术检测Ras、ERK1蛋白是否表达及其表达量有无改变,并以β-actin蛋白作为内参蛋白。4、应用不同浓度的叶绿酸50ug/ml、30ug/ml、20ug/ml、10ug/ml处理肝癌细胞株SMMC-7721,37.0℃、5%CO2条件下培养,观察叶绿酸对SMMC-7721细胞生长的影响,选择适宜浓度（20ug/ml、10ug/ml）的叶绿酸进一步实验,尽可能排除叶绿酸的对实验的干扰。5、应用不同浓度的叶绿酸20ug/ml、10ug/ml与AFB11.0ug/ml共同处理肝癌细胞株SMMC-7721,37.0℃、5%CO2条件下培养,观察叶绿酸对AFB1的作用,选择对肝癌细胞生长无明显影响且能抑制AFB11.0ug/ml作用的叶绿酸20ug/ml作为进一步实验的干预因素。6、应用叶绿酸20ug/ml与AFB11.0ug/ml共同处理SMMC-7721细胞,37.0℃、5%CO2条件下培养。24小时后收集细胞,检测肝癌细胞株SMMC-7721细胞周期变化及凋亡情况。7、应用叶绿酸20ug/ml与AFB11.0ug/ml共同处理SMMC-7721细胞,37.0℃、5%CO2条件下CO2孵育箱培养。分别于处理后0、30、60、90、120分钟收集细胞提取细胞蛋白质,同样选择Ras、ERK1蛋白作为指标应用免疫印迹术检测Ras、ERK1蛋白表达情况。结果1、不同浓度的AFB1对肝癌细胞株SMMC-7721的影响不同,AFB120.0ug/ml、AFB110.0ug/ml、AFB15.0ug/ml表现为细胞毒性,细胞不同程度死亡,并呈浓度依赖性;AFB11.0ug/ml、AFB10.1ug/ml、AFB10.01ug/ml对肝癌细胞株SMMC-7721具有促进增殖的作用,以AFB11.0ug/ml浓度显著,AFB10.1ug/ml、AFB10.01ug/ml作用渐减弱。2、AFB11.0ug/ml处理SMMC-7721细胞后37.0℃、5%CO2条件下培养24小时,S期细胞比对照组增加,G1期细胞比对照组减少。3、肝癌细胞株SMMC-7721表达Ras、ERK1蛋白。4、AFB11.0ug/ml处理SMMC7721细胞后90、120分钟试验点比空白对照组Ras、ERK1蛋白表达量增加。5、叶绿酸处理细胞后,发现叶绿酸30ug/ml即可诱导肝癌细胞株SMMC-7721凋亡,20ug/ml、10ug/ml对肝癌细胞株SMMC-7721生长无明显影响。6、叶绿酸与AFB11.0ug/ml共同作用于肝癌细胞株SMMC-7721,叶绿酸20ug/ml可抑制AFB1对肝癌细胞的促增殖作用;叶绿酸10ug/ml对AFB1作用无明显影响。7、叶绿酸20ug/ml处理AFB11.0ug/ml作用下的肝癌细胞后37.0℃、5%CO2条件下培养24小时,S期细胞比AFB1组减少8、叶绿酸20ug/ml、AFB11.0ug/ml共同处理肝癌细胞株SMMC-7721,37.0℃、5%CO2条件下培养,90、120分钟试验点比AFB11.0ug/ml组Ras、ERK1蛋白表达量降低。结论1、黄曲霉毒素B1对肝癌细胞株SMMC-7721增殖活性具有增强作用2、黄曲霉毒素B1能够活化人肝癌细胞株SMMC-7721中的Ras-ERK通路并可能通过活化Ras-ERK通路干预细胞周期调控、促进肝癌细胞株SMMC-7721增殖;以及可能通过活化Ras-ERK通路在肝癌的发生中发挥作用,其激活Ras-ERK通路的机制有待进一步研究3、叶绿酸对黄曲霉毒素B1具有抑制作用,作用机制有待进一步研究。同时叶绿酸能够诱导肝癌细胞株SMMC-7721细胞凋亡,从而可能通过诱导肿瘤细胞凋亡,发挥抗癌作用,作用机制有待进一步研究
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