论文摘要
目的氧疗是一种临床常用治疗手段,挽救了大量新生儿的生命,但可带来由于持续用氧治疗后的一种肺氧化应激性损伤疾病-支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia,BPD）。肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolar typeⅡepithelial cell, AT-Ⅱ）为肺泡上皮的干细胞,肺泡上皮的修复完全依赖AT-Ⅱ的增殖、分化为肺泡Ι型上皮细胞（alveolar typeⅠepithelial cell, AT-Ι）。BPD的发生发展与AT-Ⅱ增殖、存活和凋亡密切相关。而p38蛋白激酶（p38 MAP kinase, p38MAPK）为丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）信号通路三个主要的亚家族之一,与细胞增殖、存活和凋亡密切相关。本文以体外培养的大鼠原代AT-Ⅱ为研究对象,以不同浓度过氧化氢（H2O2）处理AT-Ⅱ,探讨活性氧（reactive oxygen species,ROS）诱导AT-Ⅱ细胞存活、凋亡及p38MAPK对氧化应激状态下AT-Ⅱ修复存活,凋亡的调控作用。方法以免疫粘附法分离纯化清洁级Spraque-Dawley成年大鼠AT-Ⅱ,台盼兰拒染法鉴定细胞活性,改良巴氏染色法鉴定细胞纯度,电镜直接观察AT-Ⅱ细胞形态为细胞培养物定性。采用过氧化氢（H2O2）处理模拟机体ROS攻击AT-Ⅱ的体内情况,建立氧化性细胞损伤模型。实验分为对照组（加无血清培养基）、H2O2处理组（无血清培养基中含10、100、500和1000μM H2O2）和p38MAPK干预组（加p38MAPK抑制剂SB203580）。采用倒置显微镜、透射电镜观察细胞形态学变化,以四甲基偶氮唑盐酶反应比色法（MTT法）检测细胞存活率,Annexin-Ⅴ和PI双染色后流式细胞术检测细胞凋亡率,蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测H2O2处理后AT-Ⅱ细胞磷酸化p38MAPK （Phospho-p38MAPK, p-p38MAPK）的表达,并观察p38MAPK特异性抑制剂SB203580干预后细胞存活率和凋亡率的变化及p-p38MAPK表达的变化。结果以胰蛋白酶分离,免疫粘附法纯化建立AT-Ⅱ原代培养的方法可收获细胞1-2×107个/鼠,纯度和活性>90%。电镜观察培养40小时的细胞,可见AT-Ⅱ细胞特征性结构——嗜锇性板层小体。H2O2处理AT-Ⅱ180min,与对照组比较,10μM H2O2处理组的细胞形态无明显差异;100μM H2O2处理组细胞间隙稍增宽;500μM H2O2处理组细胞间隙增宽,贴壁细胞数量减少,细胞皱缩,胞内可见空泡;1000μM H2O2处理组贴壁细胞数量大大减少,细胞皱缩明显,可见脱壁细胞和细胞碎片,同时透射电镜下观察到凋亡细胞的凋亡小体。MTT法和流式细胞术检测结果显示,10μM和100μM H2O2攻击AT-Ⅱ180min,细胞存活率和凋亡率与对照组比较无明显变化（P>0.05）,而500μM和1000μM H2O2攻击AT-Ⅱ可使细胞存活率由对照组的97.50±2.588%降至80.67±6.121%和44.50±2.429%（P<0.05）,凋亡率由7.8960±4.4065%增至29.2420±4.2045%和48.8800±8.6261%（P < 0.05）。使用p38MAPK抑制剂SB203580干预后500μMH2O2处理AT-Ⅱ180min,与单纯500μMH2O2处理组比较,AT-Ⅱ贴壁细胞数量进一步减少,细胞间隙增宽,细胞皱缩明显,可见脱壁细胞和细胞碎片,AT-Ⅱ存活率更加降低（P<0.05）和凋亡率进一步增高（P<0.05）。另外,H2O2可刺激p-p38MAPK阳性表达,以刺激15min表达最强。p38MAPK抑制剂SB203580能有效阻断H2O2刺激下p-p38MAPK的阳性表达。结论1.以胰蛋白酶分离、免疫粘附法纯化建立AT-Ⅱ细胞原代培养的方法,能够获得满意的细胞产量、纯度和活性,满足氧化性细胞损伤模型的制备。2. ROS可以诱导AT-Ⅱ细胞存活率下降和调亡率增加,并呈剂量依赖性。3. p38MAPK信号通路参与了氧化应激状态下AT-Ⅱ细胞存活和凋亡的信号转导途径,对氧化应激状态下的AT-Ⅱ细胞可能起到保护作用。