论文摘要
肾纤维化是多种原因引起肾脏损伤后的共同转归,是慢性肾衰竭的主要病理学基础。阿霉素所致的肾纤维化动物模型具有慢性进行性肾损害的特点,与人类进行性肾脏疾病的表现非常类似。三七总皂苷（ Panax notoginseng saponins,PNS）是五加科人参属植物三七的主要有效活性成分,其块根中含皂苷约12%,其中主要成分与人参一致,即人参二醇型皂苷Rb1、人参三醇型皂苷Rg1,总含量较人参高。它具有扩张血管,抑制血小板聚集,延长凝血时间,降血脂,清除自由基,抗炎,抗氧化等药理作用。中医理论认为,肾纤维化等结缔组织增生性疾病与血瘀证相关。活血化瘀药物对此类疾病有独特功效,三七补血而不留瘀,化瘀而不伤血的功效又契合祛邪扶正的中医治疗原则。研究认为,在肾纤维化发生发展过程中,有多种生长因子发挥重要作用。结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）作为转化生长因子-β的下游因子,要通过介导细胞增殖、促进细胞外基质合成等作用,在肾纤维化中扮演重要角色。所以,研究三七总皂苷对CTGF异常表达的抑制作用对阐释其防治大鼠阿霉素肾病的作用机制具有重要意义。目的本研究旨在观察三七总皂苷对阿霉素肾病大鼠生理生化指标、肾脏病理变化以及肾组织CTGFmRNA及其蛋白表达的影响。观察三七总皂苷对体外培养的肾小球系膜细胞在脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激下引起的细胞增殖和CTGFmRNA及其蛋白表达的影响。从整体、组织、细胞、蛋白质和基因水平探讨三七总皂苷延缓肾纤维化的作用机制,为进一步研究其防治肾纤维化的作用机理提供实验依据。方法整体实验,采用单侧肾切除合并阿霉素腹腔注射造大鼠阿霉素肾病模型。将大鼠分为正常组、假手术组、模型组、苯那普利组和三七总皂苷组,并检测下列指标。1.每周检测大鼠体重,隔周进行尿蛋白定量检测,于实验第10周处死大鼠,分离血清,测定其中BUN、Scr、Cho、TG、TP、Alb的含量,肾组织做HE染色、六胺银染色、Mallory染色和Masson染色观察肾组织病理形态学变化;2.采用原位杂交法检测各组大鼠肾组织内CTGFmRNA的表达;3.采用免疫组织化学法检测各组大鼠肾组织内CTGF蛋白的表达。细胞实验,采用肾小球系膜细胞体外培养。将细胞分为空白组、LPS组、苯那普利组、三七总皂苷组。除空白组外,其余各组均用LPS刺激,检测下列指标。1.用MTT法检测三七总皂苷对LPS刺激肾小球系膜细胞在12h,24h,48h和60h增殖的影响;2.采用RT-PCR法检测LPS诱导肾小球系膜细胞CTGFmRNA的表达情况和三七总皂苷对该指标的影响;3.采用细胞爬片免疫组化法和Western-blot法检测LPS诱导肾小球系膜细胞CTGF蛋白的表达情况和三七总皂苷及Rg1、Rb1对该指标的影响。结果1.三七总皂苷组大鼠体重明显高于模型组（P<0.05或P<0.01）,三七总皂苷可以减少阿霉素肾病大鼠尿蛋白排泄（与模型组相比P<0.05）,降低血肌酐和尿素氮,降低血浆胆固醇和甘油三脂,升高血浆总蛋白和白蛋白（与模型组相比P<0.05）,从而改善肾功能,纠正脂质代谢紊乱,减轻肾脏的病理损伤（肾小球硬化指数和肾间质病变评分结果与模型组相比P<0.01）;2.三七总皂苷组各个时间点LPS刺激引起的肾小球系膜细胞增殖情况显著低于LPS组（P<0.05）,该作用与苯那普利组相比无显著差异;3.三七总皂苷组阿霉素肾病大鼠肾组织CTGFmRNA的表达显著降低（与模型组相比P<0.05）,并且,CTGF蛋白表达明显降低（与模型组相比P<0.01）与苯那普利组相比无显著差异;4.三七总皂苷组LPS诱导的肾小球系膜细胞内CTGFmRNA的表达明显降低（与LPS组相比P<0.01）;5.三七总皂苷及Rg1、Rb1大小剂量组LPS诱导的肾小球系膜细胞内CTGF蛋白的表达与LPS组相比也明显降低（P<0.05）,上述指标与苯那普利组相比均无显著差异。结论1.三七总皂苷能够改善阿霉素肾病大鼠的代谢异常,改善肾功能,减少尿蛋白排泄量,减轻肾纤维化病变程度。2.三七总皂苷在各个时间点均能够明显抑制由脂多糖诱导的体外培养GMCs异常增殖;三七总皂苷能够显著抑制阿霉素肾病大鼠肾组织固有细胞和LPS刺激引起的体外培养GMCs内CTGFmRNA及其蛋白的异常表达;其有效成分Rg1和Rb1均能够抑制LPS诱导的GMCs内CTGF蛋白的表达。这可能是三七总皂苷防治大鼠阿霉素肾病的重要机制。
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