叶绿体ATP合酶的活性调节与亚基的定点突变

论文题目: 叶绿体ATP合酶的活性调节与亚基的定点突变

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物学

作者: 董慧

导师: 魏家绵

关键词: 叶绿体,光合磷酸化,亚基,定点突变

文献来源: 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）

发表年度: 2005

论文摘要: 叶绿体ATP合酶是存在于高等植物类囊体膜上的四大蛋白复合体之一,由镶嵌在膜内的CF0和突出于膜外的CF1组成,是光合作用能量转换的关键酶。它能利用与光合电子传递耦联的质子转运形成的跨膜质子动力势催化光合磷酸化的末端反应,将ADP和无机磷Pi合成ATP。因此,对ATP合酶进行深入的研究在生物能力学上具有重要的意义。本论文工作主要是研究四环素对光合磷酸化作用的促进作用及其在ATP合酶上的作用部位,和通过定点突变研究合酶中具有重要功能的ε亚基的结构与功能。1. 用四环素处理菠菜的离体叶绿体,研究它对菠菜叶绿体的光合磷酸化作用和电子传递等反应的影响。用低浓度的四环素溶液处理菠菜叶绿体, 观测到它可促进非循环和循环光合磷酸化和电子传递,因对非循环光合磷酸化促进程度比对电子传递的大,所以P/O值也升高。叶绿体毫秒延迟发光也同样得到促进,但叶绿体的Mg2+-ATPase活性只稍有提高。这些结果说明菠菜叶绿体对于四环素很敏感。用四环素处理游离的CF1后,发现CF1的Mg2+-ATPase活力稍有下降,并观测到CF1蛋白在277nm和295nm两个波长下的荧光发射光谱的荧光峰强度均明显减弱,说明四环素在CF1上有作用部位。随后,分别用作用于CF1的整个结构、γ亚基和β亚基的戊二醛、NEM和TNBS处理CF1,比较四环素处理后的CF1荧光发射光谱和这些已知与CF1各亚基有相互作用的药物处理后的荧光发射光谱的差异。其结果呈现这些处理与四环素处理的CF1荧光发射光谱的峰位相同,但戊二醛、NEM和TNBS处理后的CF1荧光发射光谱的峰值均低于对照。用50μmol/L四环素处理后的发射光谱峰值更接近于NEM处理后CF1的发射光谱。由此初步推测,四环素在CF1上的作用部位在其γ亚基上或其邻近部位,四环素的结合加强了ATP合酶亚基间的相互作用,增加了跨类囊体膜两侧的质子动力势,从而促进ATP合成和提高P/O值。2. 用定点突变的方法将叶绿体ATP合酶ε亚基第47 位甘氨酸替换成亮氨酸,精氨酸,丙氨酸和谷氨酸,分别产生εG47L, εG47R, εG47A and εG47E四个突变体。这些突变体对CF1（–ε） 的Ca2+-ATPase活性的抑制均比野生型的弱。

论文目录:

摘要

缩写

综述部分

第一章 ATP 合酶的结构与功能研究进展

1. 概述

2. ATP 合酶的亚基组成和结构

2.1 ATP 合酶各亚基基因的组成、定位及同源比较

2.2 ATP 合酶的亚基组成

2.3 ATP 合酶的结构

2.3.1 F1Fo的整体结构

2.3.2 F1亚基的结构

2.3.3 F各亚基的结构

3. ATP 合酶的旋转催化

3.1 结合改变机理(binding change mechanism)

3.2 旋转催化(rotational catalysis)的研究

3.2.1 旋转催化的直接证据

3.2.2 ATP合成酶的转子(rotor):γεc_(ring)

3.2.3 ATP合成酶的定子ATP合酶的定子(stator):ab_2α_3β_3δ

3.2.3.1 62与δ的相互作用

3.2.3.2 62δ与a和αβ的相互作用

3.2.4 旋转的发动机

4. ATP 合成酶旋转催化的调节

4.1 ATP 合酶的二聚体形式

4.2 F1的结构和核苷酸结合位点的协同性

4.3 旋转催化的步骤

4.4 Fo以及质子动力势外流促进扭力矩的形成

5. ε亚基的结构与功能的研究

5.1 对ε亚基功能的研究

5.1.1 ε亚基的交换、重组对酶活力的影响

5.1.2 ATP 合酶ε亚基突变的研究

5.1.2.1 定点突变

5.1.2.2 缺失突变

5.2 对ε亚基在旋转催化中结构与功能的研究

5.2.1 ε亚基与γ和c 亚基组成转子

5.2.2 ε亚基构象改变对酶活性的调节

6. 参考文献

论文部分

第二章 低浓度四环素促进叶绿体的光合磷酸化和P/O 值

1. 摘要

2. 引言

3. 材料和方法

3.1 试验材料

3.2 方法

4. 结果

4.1 四环素对叶绿体光合磷酸化活力和电子传递速率的影响

4.2 四环素对叶绿体毫秒延迟发光的影响

4.3 四环素对Mg~(2+)-ATPase活力的影响

4.4 CF_1荧光光谱的检测

5. 讨论

6. 参考文献

第三章 叶绿体 ATP 合酶ε亚基47 位保守甘氨酸的定点突变对其功能的影响

1. 摘要

2. 引言

3. 材料和方法

3.1 试验材料

3.2 方法

4. 结果

4.1 菠菜叶绿体ATP合酶ε亚基表达载体的构建、蛋白表达及纯化

4.2 ε及其突变体对CF_1(-ε)和氧化型CF_1(-ε) ATPase活力的抑制

4.3 体外检测ε和γ亚基之间的相互作用

4.4 ε及其突变体对叶绿体和重组类囊体膜光合磷酸化活力的影响

4.5 ε及其突变体对叶绿体ms-DLE 强度的影响

5. 讨论

6. 参考文献

附录:发表文章目录

致谢

发布时间: 2005-09-09

参考文献

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