论文摘要
核桃的品质问题一直是核桃产业发展的制约因子,其壳的厚薄影响到出仁率和取食的难易,是造成核桃市场巨大价差的最重要的质量指标,因此,壳厚是核桃研究的重点和难点。本实验以采自会理县的薄壳核桃类群和采自冕宁的厚壳核桃类群为试材,利用RAPD技术,参照BSA法,寻找与核桃壳厚薄相关的分子标记,并进一步将该RAPD标记转化为特异性的SCAR标记,使核桃育种从表型选择逐步过渡到基因型选择,进而使核桃数量性状研究进入到分子水平阶段。分别对保存了两年,一年,四个月及10d的核桃样品采用核沉淀法提取DNA,用核酸蛋白仪检测DNA纯度和浓度,并行DNA模板的电泳检测。结果表明,在一定条件下核桃保存时间过长,其核酸结构易发生改变而降解,严重影响DNA的提取效果;但保存一年的核桃样品,DNA的完整性可与保存10d的相媲美,效果较好。利用正交试验对影响RAPD—PCR反应体系的各因素进行研究,建立适合核桃RAPD反应的最佳反应体系,即模板DNA 20ng;10×PCR buffer 2.5μL;Taq酶0.04U/μL;Primer 0.36μmol/L;Mg2+2.0 mmol/L;dNTPs 0.15 mmol/L,总反应体系25μl。参照分群法（BSA）建立薄壳核桃和厚壳核桃的近等基因池（DNA-pool）。从赛百胜公司生产的10组共200个随机引物中选出13个多态性引物,进一步用这13个引物进行单株验证,发现只有引物SBS-T16（GGTGAACGCT）在薄壳核桃的5个单株中重复扩增出了一条约1200bp的特异带,而厚壳核桃的5个单株中无此特异性带。将此特异片段回收、纯化、克隆到pUCm-T载体后进行蓝白斑筛选,阳性克隆用于测序。结果表明该片段的准确大小为1224bp。对测定序列进行genebank在线分析,发现该标记尚未见报道。根据该序列设计了一对特异性引物P1和P2,该特异性标记被转化为SCAR标记。初步认为SBS-T161224可能是与核桃可厚薄性状相关的分子标记,该标记需进一步加以确定。以下是用于SCAR标记的引物序列:Sense Primer:GGTGAACGCTTAAAGAAGCTCCAntisense Primer:GGTGAACGCTGCCAAGATATC