论文摘要
卵巢癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,由于其起病隐匿,缺乏早期诊断的指标和有效的治疗手段,死亡率高居妇科恶性肿瘤榜首。而且近年来卵巢癌的发病比率呈上升趋势,因此探索肿瘤治疗的新方法在临床上具有重要意义。Her2基因是人类表皮生长因子受体2（Human Epidermal Growth Factor Receptor-type 2）的编码基因,所编码的蛋白为185kD,是一种跨膜受体糖蛋白,具有酪氨酸激酶活性。研究表明Her2过表达可以增加细胞的增殖、生长、细胞浸润和转移,引起血管内皮生长因子和网织红细胞增加及血管生成,增加肿瘤的转移能力。该基因是人类肿瘤中发生改变频率最高的癌基因之一。在许多上皮来源的恶性肿瘤如乳腺癌、上皮性卵巢癌、肺癌组织等有研究显示均存在Her2表达过高,因此Her2基因被认为是上皮细胞起源的肿瘤治疗的有效靶点之一。研究表明针对Her2胞外区的人源化单克隆抗体Herceptin对肿瘤细胞的生长有一定的抑制作用,用于晚期乳腺癌的治疗已经取得了显著疗效。本实验以Her2原癌基因为靶标,Her2高表达的卵巢癌细胞系SKOV-3作为靶细胞,利用基因重组方法,构建其siRNA的重组腺病毒。通过含有腺病毒E1的HEK293细胞包装,获得高滴度的重组腺病毒。病毒感染卵巢癌细胞株SKOV-3后通过检测Her2蛋白的表达观察Her2基因的沉默效果,同时观察该重组腺病毒对细胞的生长抑制作用。为进一步研究Her2基因功能及其下游调节基因提供实验基础,有望为卵巢癌基因治疗提供一种选择手段。目的:1.针对Her2基因构建siRNA腺病毒表达载体;2.观察腺病毒介导的Her2siRNA对卵巢癌细胞SKOV-3的生长抑制作用;3.检测重组腺病毒对肿瘤抗原Her2表达的影响。方法:1.根据Her2基因mRNA选取两个siRNA作用位点并设计合成寡核苷酸,克隆入pSuppressor构建siRNA表达载体（Her2aRNAi-pSuppressor、Her2bRNAi-pSuppressor）;2.利用MluⅠ和HindШ双酶切将所需的U6启动子和Her2siRNA克隆入经MluⅠ和EcoRⅠ双酶切的穿梭载体pShuttle中,得到Her2asiRNA/pShuttle和Her2bsiRNA/pShuttle;3. Her2asiRNA/pShuttle、Her2bsiRNA/pShuttle通过基因重组方法将表达siRNA所需的元件与腺病毒DNA相连,用PCR和酶切鉴定方法进行筛选和鉴定,获得重组腺病毒Adeno-Her2aRNAi和Adeno-Her2bRNAi,并进一步在293细胞中包装、扩增得到高滴度的重组腺病毒;4.利用得到的重组腺病毒感染卵巢癌细胞系SKOV-3,采用WesternBlot法检测感染前后Her2蛋白表达水平的变化;5.利用细胞Proliferation法测定病毒感染后对卵巢癌SKOV-3细胞系生长的影响。结果:1.成功构建表皮生长因子受体2（Her2）siRNA的腺病毒表达载体（Adeno-X-lacZ为空载体）,滴度达108-1010pfu/mL。该重组腺病毒表达载体经Odessey红外荧光扫描成像系统分析显著抑制SKOV-3细胞中Her2的蛋白表达水平（p<0.01）,光密度扫描测定的结果显示Adeno-Her2aRNAi组72h降低70% ,Adeno-Her2bRNAi组48 h、72 h分别降低50 %和80 %（以0 h的Her2表达量为100%）;2.细胞增殖曲线显示重组腺病毒可明显抑制SKOV-3细胞的生长（p<0.05）,与空载体组比,Adeno-Her2aRNAi和Adeno-Her2bRNAi组在MOI为25,72 h时的增殖抑制率分别为12 %、15 %;在MOI为50,72 h时的增殖抑制率分别为31 %、38 %;在MOI为100,72 h时的增殖抑制率分别为47 %、48 %。因此Adeno-Her2bRNAi组比Adeno-Her2aRNAi组抑制效应更好。结论:1.含有Her2siRNA的重组腺病毒Adeno-Her2aRNAi和Adeno-Her2bRNAi能够抑制Her2阳性细胞SKOV-3中Her2蛋白表达水平;2.针对Her2的2种siRNA腺病毒Adeno-Her2aRNAi和Adeno-Her2bRNAi均可以抑制卵巢癌SKOV-3细胞的生长,表明此种方法构建的siRNA腺病毒表达体系可在体外实验中有效发挥作用。