克雷伯氏肺炎杆菌中甘油代谢副产物敲除对1,3-丙二醇发酵的研究

论文摘要

克雷伯氏肺炎杆菌（Kpneumoniae）是重要的工业微生物,可利用甘油为底物发酵产生1,3-丙二醇（1,3-PD）。在代谢途径中,还原途径产生1,3-PD,氧化途径产生一系列副产物,如乳酸、乙酸、2,3-丁二醇（2,3-BD）等。在本文中,首先选择敲除乳酸来探讨其对1,3-PD发酵的影响,利用Red同源重组的方式分别敲除了两个编码D-乳酸脱氢酶的基因IdhA （99pbp）和dld-ldhA （1746bp）,获得突变株KG1-1和KG1-2。对KG1-1和KGl-2的发酵液进行分析,证实了KG1-1为D-乳酸不产的菌株,但其1,3-PD生产能力没有明显提高。为了获得1,3-PD高产菌株,本文又尝试敲除2,3-BD途径,构建了KG1-3和KG1-4两个菌株,代谢产物分析表明,KG1-3是2,3-BD不产的菌株,且敲除2,3-BD途径后,导致1,3-PD浓度和菌浓分别降低60%和43%,而乳酸和丙酮酸则分别提高了225%和140%。为了进一步提高1,3-PD产量,在KG1-3的基础上敲除1dhA,构建了KG1-5菌株,该菌株的1,3-PD产量和菌浓与原始菌比恢复了70%和90%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 1,3-丙二醇
• 1.1.1 1,3-丙二醇的化学合成
• 1.1.2 1,3-丙二醇的生物法合成
• 1.2 克雷伯氏肺炎杆菌
• 1.2.1 甘油代谢途径
• 1.3 主要副产物
• 1.3.1 乙酸
• 1.3.2 乳酸
• 1.3.3 2,3-丁二醇
• 1.3.4 bud操纵子
• 1.4 1,3-丙二醇生产菌株的代谢工程研究
• 1.4.1 E.coli的基因工程改造
• 1.4.2 除去K.pneumoniae中甘油代谢副产物
• 1.4.3 过表达K.pneumoniae中甘油还原途径关键酶
• 1.4.4 K.pneumoniae中还原途径酶的定向进化
• 1.5 同源重组技术
• 1.6 Red同源重组技术辅助质粒
• 1.6.1 pKD46质粒
• 1.6.2 pKD4质粒
• 1.6.3 pCP20质粒
• 1.7 本课题研究内容及意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 引物
• 2.1.3 分子生物学试剂
• 2.1.4 化学试剂
• 2.1.5 培养基及抗生素
• 2.1.6 主要仪器
• 2.1.7 应用软件及程序
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 微生物培养
• 2.2.2 菌种保藏
• 2.2.3 PCR扩增目的片段
• 2.2.4 DNA琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.5 PCR产物回收
• 2.2.6 TA克隆
• 2.2.7 DH5α感受态制备
• 2.2.8 化转
• 2.2.9 质粒抽提
• 2.2.10 DNA的酶切
• 2.2.11 DNA的连接
• 2.2.12 K.pneumoniae的电转化
• 2.2.13 阳性克隆的筛选
• 2.2.14 发酵
• 2.3 发酵液分析
• 2.3.1 GC分析
• 2.3.2 HPLC分析
• 第3章 结果与讨论
• 3.1 突变株KG1-1和KG1-2的构建
• 3.1.1 K.pneumoniae/pKD46-Tc菌株的筛选
• 3.1.2 两步PCR法扩增打靶片段
• 3.1.3 IdhA和dld的基因敲除
• 3.1.4 卡那抗性的消除
• 3.2 KG1-1和KG1-2的代谢分析
• 3.3 bud操纵子的分析
• 3.3.1 bud操纵子的基因序列分析
• 3.4 2,3-丁二醇不产菌株的构建
• 3.4.1 KG1-3的代谢分析
• 3.5 KG1-5的构建
• 3.5.1 乳酸敲除对KG1-5发酵生产1,3-丙二醇的影响
• 第4章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 展望
• 参考文献
• 致谢