细胞特异性的DNMT1甲基化修饰对其稳定性的调控

论文摘要

甲基化修饰是真核生物中核小体组蛋白的一种极为重要的翻译后修饰。甲基化修饰协同其它翻译后修饰方式共同调控染色质的结构和基因的转录活性。除了组蛋白之外,很多其它的细胞功能蛋白,包括转录因子和抑癌因子等,都被发现可以发生甲基化修饰。随着一系列非组蛋白甲基化修饰的鉴定,显示甲基化修饰可能是一种普遍的调控蛋白质稳定性的翻译后修饰方式。最近的研究结果表明Dnmt1(DNA甲基转移酶1)的甲基化修饰可以促进Dnmt1通过蛋白酶体途径被降解。本论文中我们发现甲基化修饰对Dnmt1稳定性的调控存在细胞特异性。我们发现在LNCaP细胞系内LSDl的缺失会导致Dnmt1蛋白的不稳定；而在293T和Hela细胞系内,LSDl与其同源蛋白AOF1都参与了对Dnmt1蛋白稳定性的调控；但在HCT116细胞中Dnmt1的蛋白水平并没有受到LSD1knockdown的影响。我们以及其他一些实验室的结果共同显示,在一些细胞系中,LSD1可以使Dnmt1发生去甲基化而使该蛋白变得更加稳定,这一发现也为组蛋白甲基化与DNA甲基化提供了一些机制上的关联。此外,我们发现的LSD1对Dnmt1稳定性的细胞特异性的调控也使Dnmt1在不同细胞系内其稳定性的调控方式变得更为复杂。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 综述
• 1 组蛋白的甲基化
• 1.1 组蛋白的甲基转移酶
• 1.2 组蛋白去甲基化酶
• 1.3 组蛋白甲基化与DNA甲基化
• 2 组蛋白甲基化修饰酶对非组蛋白的调控
• 2.1 ：组蛋白甲基转移酶对非组蛋白的修饰与调控
• 2.2 组蛋白去甲基化酶LSD1对非组蛋白的修饰与调控
• 3 DNA甲基转移酶DNMT1
• 3.1 DNMT1的稳定性的调控
• 材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 菌株和细胞株
• 1.2 质粒
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 1.5 实验试剂的配制
• 2 实验方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 细胞转染
• 2.3 稳定细胞株的建立
• 2.4 免疫染色
• 2.5 免疫沉淀
• 2.6 Western Blotting的实验方法
• 2.7 从贴壁细胞中抽提总RNA的步骤
• 2.8 RT-Q-PCR实验步骤
• 实验结果
• 1 LSD1 的缺失使DNMT1 的蛋白稳定性下降
• 2 建立并检测沉默LSD1的LNCAP、2 93T及HELA稳定细胞系
• 3 LNCaP稳定细胞系中LSD1的缺失导致Dnmt1蛋白水平的下降
• 4 293T和Hela细胞中LSD1与AOF1共同参与对Dnmt1的调控
• 5 HCT116细胞内LSD1对Dnmt1稳定性没有明显的调控作用
• 6 组蛋白甲基转移酶SET7和SET8参与调控Dnmt1的稳定性
• 讨论与展望
• 附录
• 1 缩略词
• 2 LSD1 shRNA所用空载pGIPz-shRNA的图谱和性质
• 3 LSD1的两条shRNA序列信息及Dnmtl的RT引物信息
• 参考文献
• 致谢