重金属胁迫诱导水稻发生可遗传的表观遗传变异及其可能作用于水稻提高抗重金属能力的机制的研究

论文摘要

重金属胁迫作为非生物胁迫的一种可引起植物的胁迫应答。这里我发现重金属胁迫后水稻表现出明显的生长抑制,并且呈现一个剂量依赖的抑制效应,即浓度越高,抑制作用越大。由于表观遗传修饰具有可应答于生物体内在胁迫和外部胁迫的特点,我相信重金属胁迫可诱导表观遗传修饰如DNA甲基化变异和基因表达变异的发生。在研究中我发现重金属胁迫可诱导水稻在一些特定的序列上发生DNA甲基化的变异和基因表达的变异。这些变异具有以下的特点:（1）变异主要为CNG位点的去甲基化变异;（2）改变的甲基化类型在自交的一代中发生新的去甲基化变异,在自交二代中基本可遗传一代的甲基化类型;（3）那些负责建立和维持胞嘧啶的甲基化类型和/或染色质结构的基因如DNA甲基转移酶基因,5-甲基胞嘧啶糖基化酶基因和染色质重构因子（DDM1）可被重金属胁迫诱导发生表达的变异,在一定程度上可能是导致DNA甲基化变异的原因之一;（4）特定序列（转座子和基因）的表达改变主要为表达的上调,偶尔的表达下调也存在,改变的基因表达可不同程度的遗传给自交一代和二代植株。基因表达的改变和自身序列的甲基化改变不存在一一对应的关系,但是大体上序列的去甲基化变异对应着基因表达的上调。此外,重金属胁迫后的植株表现出一定程度的剂量依赖的重金属抗性应答,这可能与水稻重金属转运蛋白OsHMAs基因的表达增强有关。根据以上几方面的研究我认为重金属胁迫诱导的表观遗传变异可为研究植物抗重金属胁迫的机制和培育抗重金属水稻新品种提供一定的理论依据和参考。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 1 DNA 甲基化的分子生物学研究进展
• 1.1 植物基因组中的 DNA 甲基化
• 1.2 植物基因组中 DNA 甲基化的建立和保持
• 1.3 植物基因组中 DNA 去甲基化作用
• 1.4 DNA 甲基化的生物学功能
• 1.4.1 DNA 甲基化与基因组防御
• 1.4.2 DNA 甲基化与基因表达
• 2 非生物胁迫和表观遗传学
• 3 本研究的背景、目的和意义
• 材料与方法
• 1. 实验材料
• 2. 实验方法
• 2.1 植物材料的重金属胁迫处理
• 2.2 植物基因组 DNA 的提取与纯化
• 2.3 Southern 杂交分析
• 2.3.1 DNA 酶切
• 2.3.2 Southern 印迹
• 2.3.3 探针的分离
• 2.3.4 探针的标记，Southern 杂交记杂交信号的检测
• 2.4 亚硫酸盐测序
• 2.4.1 C-T 转换试剂使用前的制备
• 2.4.2 C-T 转换的操作过程
• 2.4.3 序列的PCR 扩增及纯化和回收
• 2.4.4 感受态细胞的制备，转化，α互补筛选及阳性克隆的PCR 测序
• 2.5 植物总RNA 的提取及RT-PCR
• 2.5.1 植物总 RNA 的提取
• 2.5.2 反转录
• 2.5.3 检测总RNA 中DNA 污染是否完全去除及反转录第一链合成是否成功
• 2.5.4 RT-PCR、琼脂糖电泳检测
• 2.6 植物抗重金属能力的检测
• 结果与分析
• 1 重金属处理植株表现出明显的表型变异
• 2 Southern 杂交检测重金属胁迫诱导转座子和基因发生的可遗传的DNA 甲基化变异
• 2.1 转座子和基因均发生明显的去甲基化变异，并且变异只发生在 CNG 位点
• 2.2 自交后代中甲基化变异的模式为一代发生新的或者进一步的去甲基化变异，而二代基本可稳定遗传一代的甲基化模式
• 2.3 正反交后代的结果证明序列特异的甲基化变异从父本遗传或者从母本遗传没有太大的差异
• 3 亚硫酸测序验证重金属胁迫诱导的甲基化变异
• 4 RT-PCR 检测重金属胁迫诱导甲基转移酶相关基因，5-甲基胞嘧啶糖基化酶基因和染色质重构因子（DDM1）发生的表达变异
• 5 RT-PCR 检测重金属胁迫诱导转座子和基因发生可遗传的表达的变异
• 5.1 重金属胁迫诱导松前当代转座子和基因发生明显的表达变异
• 5.2 基因表达变异的生物遗传分析
• 6 后代植物抗重金属能力提高及植物中 P1 B - 类型的 ATP 酶的表达变异
• 6.1 后代植物抗重金属胁迫能力的提高
• 6.2 P18-类型的ATP酶的表达变异
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 在学期间公开发表论文及著作情况