对舞毒蛾高毒力的Bt杀虫蛋白分析及LdMNPV PCR检测方法的建立

论文摘要

舞毒蛾（Lymantria dispar）为杂食性害虫,近年来其危害区域呈现不断蔓延趋势,给我国林业造成巨大影响。苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）和舞毒蛾核型多角体病毒（Lymantria dispar multiple-embedded nucleopolyhedro virus, LdMNPV）是对舞毒蛾防治最有效的微生物杀虫剂。本文对舞毒蛾高毒力Bt杀虫蛋白进行分析,推测对舞毒蛾高毒力的杀虫蛋白基因型；根据已公布的舞毒蛾核型多角体病毒序列,设计特异性引物,建立其PCR检测技术。具体内容及结果如下。苏云金杆菌对多种害虫具有生物活性,本文从实验室保存的7个Bt菌株中筛选出对舞毒蛾高毒力菌株4株：LSB-1、LSB-2、LSB-6、LSB-7,其96h时的LC5o分别为：1.77×107cfu/ml、1.84×107cfu/ml、1.37×107cfu/ml和2.95×l07cfu/ml,显微镜观察这些高毒菌株的杀虫晶体蛋白均为菱形,而其它几株的晶体蛋白呈圆形或不规则形状较前者略小。提取这些菌株杀虫蛋白,进行SDS-PAGE分析,电泳结果表明：这几株菌株均含有60kDa和130kDa大小的蛋白,即cry2基因和cryl基因表达的蛋白。对高毒力菌株杀虫蛋白基因cry1、cry2进行PCR扩增,扩增产物进行双酶切分析,得到了几种大小不同的酶切片段。其中LSB-1和LSB-2的cry1基因的酶切均产生3个同样的片段,其大小跟别为：1117、1039、518,LSB-6和LSB-7的ctyl基因酶切后均产生2个片段：1117、518。这4个菌株的cry2基因经双酶切后均产生2个片段：791、297。据此PCR-RFLP电泳结果可知高毒力菌株的杀虫蛋白基因型均包含crylAa、cry2Ab。根据舞毒蛾核型多角体病毒的蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因（egt）设计四对特异性引物。其中一对引物LEB可用于LdMNPV的PCR检测,其对LdMNPV基因组的灵敏度可达到1fg·mL-1。应用该技术体系从舞毒蛾带毒幼虫、卵、蛹的基因组中扩增出目的片段,证明了这一技术的可行性。对不同浓度的多角体悬浮液的扩增结果显示其检测最低量为5多角体·mL-1。形态学研究表明,从内蒙舞毒蛾体内分离到的LdMNPV中,少数表面有凹陷的孔洞,病毒粒子从这些孔洞中游离出来,这也阐明了此技术能够从多角体悬液中扩增出目的片段的原因。所以,在将来LdMNPV的检测中,可用虫体进行研磨过滤离心得到的组织液作为模板进行扩增。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 研究背景和意义
• 1.2 国内外研究现状
• 1.2.1 舞毒蛾危害现状
• 1.2.2 舞毒蛾的预防措施和防治方法
• 1.2.3 苏云金杆菌研究概况
• 1.2.4 舞毒蛾核型多角体病毒研究概况
• 1.3 研究内容及设计思路
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料及方法
• 2.1.1 供试材料
• 2.1.2 实验试剂
• 2.2 主要仪器
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 对舞毒蛾高毒力的Bt菌株及其杀虫蛋白基因分析
• 2.3.2 舞毒蛾核型多角体病毒（LdMNPV）微量检测技术的建立
• 第三章 结果与分析
• 3.1 对舞毒蛾高毒力的Bt菌株及其杀虫蛋白基因分析
• 3.1.1 舞毒蛾的饲养及传代
• 3.1.2 Bt形态观察
• 3.1.3 菌株杀虫活性
• 3.1.4 杀虫晶体蛋白的SDS-PAGE分析
• 3.1.5 杀虫晶体蛋白基因的PCR-RFLP分析
• 3.2 舞毒蛾核型多角体病毒（LdMNPV）微量检测技术的建立
• 3.2.1 病毒的增值与多角体的纯化
• 3.2.2 电镜观察
• 3.2.3 引物特异性分析
• 3.2.4 LdMNPV基因组DNA灵敏度的检测
• 3.2.5 LdMNPV的PCR检测技术的应用
• 3.2.6 LdMNPV模板的多样性研究
• 第四章 结论与讨论
• 4.1 结论
• 4.1.1 对舞毒蛾高毒力的Bt菌株及其杀虫蛋白基因分析
• 4.1.2 舞毒蛾核型多角体病毒（LdMNPV）微量检测技术的建立
• 4.2 讨论
• 4.2.1 对舞毒蛾高毒力的Bt菌株及其杀虫蛋白基因分析
• 4.2.2 舞毒蛾核型多角体病毒（LdMNPV）微量检测技术的建立
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介