论文摘要
癌症是危害人类健康的重大疾病之一,目前全世界患癌症人口约1500万,我国每年患癌死亡人数约140万。我国居民每死亡5人中,即有1人死于癌症。在国内,癌症已成为健康的重大杀手。在全球,艾滋病已超过癌症成为当前人类的最大敌人。几十年来全世界投入了无尽的人力和物力,但尚未能研制出有效的艾滋病疫苗。人类克服了麻疹、天花、流感,却在艾滋病疫苗研究上举步维艰,甚至首次对科学产生了动摇。在相当长一段时间内,癌症和艾滋病还将和人类共存,威胁着人类的生存和健康。人类一方面努力研究这两种疾病的生物特征,一方面据此设计具针对性的药物,试图攻克这两大疾病。比如,具肿瘤细胞氧自由基清除能力的超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）和能诱导艾滋病中和抗体的免疫原（人类免疫缺陷病毒包膜糖蛋白,Human immune deficiency virus envelop glycoprotein,Env）。我们的研究主要集中在这两个生物大分子的改造和体内外靶向投递上,特别是对SOD的改造上。目前对SOD的研究集中于Cu/Zn-SOD,而对Fe-SOD的研究较少。Fe-SOD的结构、功能、临床抗氧化功效报道甚少;其产业化制备,临床应用均未起步。然而,临床上Cu/Zn-SOD的体内半衰期仅为7 min,而Fe-SOD则可长达数小时,这暗示了Fe-SOD的临床应用前景。故此我们选择Fe-SOD为研究对象。SOD的肿瘤临床应用还存在诸多其它限制:如无肿瘤细胞定位能力和低细胞穿透能力;而且目前对SOD的抗肿瘤功效争论不一,存在这些争论的原因是SOD的底物（活性氧,Reactive oxygen species,ROS）在生物体内角色多样,功能复杂。我们对Fe-SOD的研究改造即基于以上2个应用缺陷与1个争论展开。第二章在蛋白水平对Fe-SOD进行改造,实现了Fe-SOD的体内外靶向给药;第三章则在基因水平对Fe-SOD进行单抗融合,实现了对肺肿瘤细胞的高效透膜和靶向杀伤,并揭示了相关的信号转导通路;第四章在单细胞水平上向读者展示了SOD底物（ROS）在肿瘤细胞中的多重角色,以及角色发挥的机制;第五章则为Fe-SOD的产业化制备、临床研究,确立了其临床上的抗氧化效果。诱导具广泛中和效果的抗人类免疫缺陷病毒抗体（即艾滋病疫苗）仍然是目前艾滋病研究领域,甚至是科学研究领域最顶尖的难点。中和抗体诱导失败的原因很复杂,一则HIV病毒表面存在各种非功能性Env免疫原,它们大量诱导出非中和性抗体;二则HIV能快速进化出各种亚型,目前很少有抗体能广泛中和各种亚型HIV。最后一章中我们制备了单一的功能性Env三聚体,并应用脂质体靶向策略对其进行免疫器官的靶向投递,在体内成功诱导了具广泛中和效果的HIV抗体。研究的内容、结论和主要创新点如下:一、Fe-SOD的克隆表达及体内外靶向投递研究制备了一种既能在体外透膜,又能在体内有效靶向到目标器官的荧光纳米脂质体。研究克隆了完整的念珠藻fe-sod基因（Accession number:AY830114）,并构建成高效表达的工程菌pET-SOD（表达量达78%）。研究还设计了一种双重荧光标记的磁靶向纳米脂质体（100 nm）,并确立了SOD靶向脂质体的体内外给药模型:体外透膜投递中,此纳米脂质体主要以内吞方式投递SOD到细胞内部;透膜后SOD从脂质体中释放,进而降低细胞氧化压力:在体内靶向投递中,小尺寸的脂质体更容易进入代谢循环,而共包裹的磁粒子则有效将SOD靶向至小鼠目标组织。这是我国首次利用基因工程方法制备获得Fe-SOD,这将解决工业上从动植物中提取Fe-SOD的来源限制问题。具靶向效果的荧光磁纳米脂质体的制备、以及Fe-SOD的体内靶向投递均属国内外首次。二、肺腺癌靶向性SOD的克隆、靶向投递及抗肿瘤机理分析研究利用基因工程技术制备了具肿瘤靶向杀伤能力的融合SOD。对Fe-SOD序列的进化和结构分析表明其羧基端适于融合改造。单链抗体（ScFv）在保持抗原抗体结合特异性的同时具有较小的分子量,易于到达靶组织。研究从分泌抗肺腺癌单克隆抗体的LC-1细胞系中提取总mRNA,PCR改造获得了抗肺腺癌ScFv。将此ScFv融合到fe-sod的羧基端,获得了具双重活性的SOD-ScFv融合蛋白。荧光标记追踪和Fe-SOD抗血清（以天然纯化的藻类Fe-SOD免疫动物制备）免疫追踪均证实SOD融合蛋白具有靶向识别并进入SPC-A-1肺腺癌细胞的能力。透膜后SOD能清除胞内超氧阴离子,缓解细胞氧化压力（表现为ROS水平降低和GSH水平升高）,进而激活Akt/P27kipl信号通路,实现了对SPC-A-1肺腺癌细胞的靶向杀伤。研究同时克服了临床上SOD无肿瘤细胞趋向性和难于进入实体瘤的两大局限;单链抗体对大分子的靶向研究为靶向领域先行者;SOD引发的Akt/P27kipl信号通路属国内外首次报道。三、ROS在SPC-A-1肺腺癌细胞中的双重角色分析研究在一个肿瘤细胞内部展开,揭示了SOD底物（ROS）的多重角色,进而提出了两条基于ROS水平控制的抗肿瘤策略。ROS在肿瘤细胞生命活动中发挥着双重角色:既可以作为“生长信号”刺激细胞增殖,又能诱导细胞死亡。细胞内Ca2+信号作为大多数应激反应的“第二信使”,在传递氧化信号,控制下游信号转导通路中发挥重要作用。本章研究在一个肿瘤细胞内部展开,以线粒体为研究中心,确定了:1) ROS爆发必需的Ca2+信号传递途径:内质网Ca2+的大量释放以及细胞外Ca2+的少量流入,引发细胞质游离Ca2+和线粒体Ca2+的超载;2)外源氧化压力下胞内ROS为内源性产生:细胞外ROS不能直接穿透细胞膜,胞内的ROS是通过Ca2+信号介导、于线粒体部位内源性产生的,这侧面回答了当前国际上“H2O2这个异常重要但又难以追踪的信号分子能否透膜”的争论。3) ROS引发的矛盾信号通路:研究认为ROS是Ca2+信使（“第二信使”）调控的“第三信使”,它的水平变化能进一步激活细胞生长相关的P-Akt和Bcl-2/cyt c通路。这两条矛盾信号通路在不同氧化压力下各自的主导作用,导致了ROS在肿瘤细胞内的双重角色。四、Fe-SOD的产业化制备和临床研究研究实施了Fe-SOD的大规模提取和临床研究。优化后的Fe-SOD大规模提取工艺一次性过柱即获得高达7 500 U/mg比活的Fe-SOD,革命性地缩短了SOD的纯化周期和纯化成本。临床上,受试者试食SOD类脂质体胶囊后血清的抗氧化指标明显降低。研究实现了Fe-SOD的预产业化,为其临床应用作了直接铺垫。五、Env的靶向性投递研究改造了HIV免疫原,并对其进行了体内免疫器官的靶向投递。我们将HIV包膜糖蛋白（Env）靶向性投递到免疫组织器官,以期产生高效的、具广泛中和效果的抗HIV抗体。研究以脂质体修饰Env三聚体,并通过对脂质体的尺寸控制来实现对免疫原的免疫器官靶向。在经典的皮下免疫注射实验中,小尺寸脂质体结合的Env有效提高了血清的HIV病毒中和活性,诱导的抗血清至少能中和4种亚型HIV-1病毒。几十年来,制备具广泛中和效果的HIV-1中和抗体一直举步维艰。当前研究证实了免疫原靶向投递策略在这个领域的可应用性。总之,我们的对SOD的改造克服了其临床应用的两大局限,而产业化临床水平的研究则直接为Fe-SOD将来的社会应用作了铺垫,这具有相当大的现实意义。ROS的肿瘤细胞角色分析,明细了SOD基于ROS清除能力的抗肿瘤机理,并在理论上提出了两条基于ROS水平控制的抗肿瘤策略。研究还首创性地在HIV-1疫苗制备领域引入免疫原靶向投递策略,并证实了其可行性,这在举步维艰的HIV-1疫苗研究领域提供了一种新型的免疫思路,具有相当大的理论和现实意义。