毛竹木质素合成相关基因的克隆与表达

论文摘要

我国是世界上竹类资源最丰富的国家,毛竹是竹类资源中最主要且应用最广泛的造林、造纸竹种,因具有速生、纤维素含量高等特点,成为优良的纸浆原材料。由于其独特的生物学特性,传统育种手段的应用受到严重制约。竹材的固有缺陷制约了竹板材加工的高速发展,竹纤维原料匮乏制约了竹浆造纸业的规模化发展。如何定向改良现有的毛竹材性,培育满足我国日益增长的工业化利用所需的多功能、多用途、高性能、高附加值的专用竹材新品种,已成为当前竹类植物遗传育种的首要任务。因此,利用生物技术等手段改变木质素含量或改变其制浆性能,创造出符合制浆造纸原料特性要求和适用于板材加工的竹材新品种,对于竹林培育和竹材工业化利用的技术进步具有重要意义。PAL是木质素生物合成途径的核心酶之一,位于苯丙烷代谢途径的入口;CCoAOMT和CAD是两种位于木质素特异合成途径下游的酶类,对于木质素合成调控也具有重要作用。本文主要在毛竹木质素生物合成酶相关基因PAL、CCoAOMT和CAD的克隆、表达鉴定以及其烟草转化等方面展开研究工作,具体研究内容如下:（1）本研究利用改良的CTAB法和Trizol法提取毛竹的DNA和RNA,质量较好,纯度高,可以用作进一步的分子生物学研究。（2）本研究利用Genome walking法克隆得到毛竹PAL基因的DNA序列,长2 736 bp,基因含有一个内含子和一个预测的启动子序列。推测的毛竹PAL基因DNA序列编码区编码712个氨基酸,分子量约为77 KD。与己知的禾本科植物绿竹、水稻的PAL基因氨基酸序列相似性分别达到95%、94%。（3）本研究利用RT-PCR和RACE法获得了毛竹PAL基因全长cDNA（命名为PAL1）,全长共2 678bp,开放阅读框架（ORF）2 142bp,编码713个氨基酸,分子量约为77 KD,与禾本科植物水稻、绿竹的PAL基因有90%以上的相似性。组织特异性表达表明,PAL1在毛竹根、茎、叶和幼苗中都有表达,但表达量存在较明显差异,根中表达量最高。（4）分别获得了长度为787 bp和1 019 bp的CCoAOMT和CAD基因片段。编码区分别编码197、282个氨基酸,与水稻、玉米、梯牧草等植物的CCoAOMT、CAD基因均具有90%以上的相似性,GenBank登录号分别为EF549579、EF549577。（5）构建了毛竹PAL1基因的原核表达载体pET16b-PAL1,在大肠杆菌BL21中诱导表达后纯化出目的蛋白。以L-苯丙氨酸为底物,测定Km值为（0.421±0.023 ）×10-3mol/L;最适反应温度是50℃;最适反应pH值为8.8。（6）构建了毛竹PAL1、CCoAOMT和CAD基因正反义植物表达载体pBI121-PAL1、pBI121-anti PAL1、pBI121-anti CCoAOMT和pBI121-anti CAD,转化农杆菌后通过叶盘法侵染烟草,经过愈伤组织继代培养得到植株幼苗。经PCR初步检测,得到转基因植株,为进一步的研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.1.1 研究背景
• 1.1.2 研究目的和意义
• 1.2 木质素生物合成途径及其调控的研究进展
• 1.2.1 木质素概述
• 1.2.2 木质素的生物合成
• 1.2.3 木质素生物合成调控的研究进展
• 1.3 PAL 基因研究进展
• 1.3.1 PAL 的分布
• 1.3.2 PAL 的酶学特性
• 1.3.3 植物PAL 基因的克隆
• 1.4 苯丙氨酸解氨酶原核表达系统研究现状
• 1.5 研究评述
• 1.6 研究目标和主要研究内容
• 1.6.1 研究目标
• 1.6.2 主要研究内容
• 1.7 研究技术路线
• 第二章 毛竹 PAL、CCoAOMT 和 CAD 基因的克隆
• 2.1 Genome walking 法克隆毛竹 PAL 基因 DNA 序列
• 2.1.1 试验材料与试剂
• 2.1.2 试验方法
• 2.1.3 结果与分析
• 2.1.3.1 毛竹PAL 基因DNA 序列中间片段的克隆
• 2.1.3.2 毛竹PAL 基因组DNA5′、3′端序列的克隆
• 2.1.3.3 重组质粒的鉴定及序列分析
• 2.1.3.4 氨基酸序列分析
• 2.2 RACE 法克隆毛竹 PAL1 基因 cDNA 序列
• 2.2.1 试验材料与试剂
• 2.2.2 试验方法
• 2.2.2.1 毛竹叶片总RNA 的提取
• 2.2.2.2 毛竹PAL 基因cDNA 中间序列的克隆
• 2.2.2.3 PAL1 基因5′端未知序列的克隆
• 2.2.2.4 PAL1 基因3′端未知序列的克隆
• 2.2.2.5 PAL1 基因全长的拼接及生物信息学分析
• 2.2.2.6 组织特异性表达
• 2.2.3 结果与分析
• 2.2.3.1 毛竹叶片总RNA 的提取
• 2.2.3.2 毛竹PAL1 基因cDNA 中间片段的克隆
• 2.2.3.3 PAL1 基因5′端未知序列的克隆
• 2.2.3.4 PAL1 基因3′端未知序列的克隆
• 2.2.3.5 PAL1 基因全长的拼接及生物信息学分析
• 2.2.3.6 组织特异性表达
• 2.3 毛竹 CCoAOMT、CAD 基因的克隆
• 2.3.1 试验材料与试剂
• 2.3.2 试验方法
• 2.3.2.1 毛竹基因组DNA 的提取
• 2.3.2.2 引物的设计及PCR 扩增
• 2.3.2.3 重组、克隆和DNA 序列分析
• 2.3.3 结果与分析
• 2.3.3.1 目的基因片段的PCR 扩增
• 2.3.3.2 重组质粒的鉴定和序列分析
• 2.3.3.3 氨基酸序列分析
• 2.4 小结
• 第三章 毛竹PAL1 的原核表达及纯化
• 3.1 原核表达载体 pET16b-PAL1 的构建及目的蛋白的表达
• 3.1.1 试验材料与试剂
• 3.1.2 试验方法
• 3.1.2.1 原核表达载体pET16b-PAL1 的构建
• 3.1.2.2 目的蛋白的表达
• 3.1.3 结果与分析
• 3.2 镍亲和柱纯化目的蛋白及免疫印迹
• 3.2.1 试验材料
• 3.2.2 试验方法
• 3.2.2.1 镍亲和柱纯化目的蛋白
• 3.2.2.2 目的蛋白的免疫印迹
• 3.2.3 结果与分析
• 3.3 重组蛋白PAL1 酶学特性研究
• 3.3.1 试验材料
• 3.3.2 试验方法
• 3.3.2.1 目的蛋白浓度的测定
• 3.3.2.2 酶活测定反应
• 3.3.2.3 Km 的测定
• 3.3.2.4 最适温度及最适pH 值的测定
• 3.3.3 结果与分析
• 3.3.3.1 酶活测定反应
• 3.3.3.2 Km 的测定
• 3.3.3.3 最适温度及最适pH 值的测定
• 3.4 小结
• 第四章 毛竹PAL1 等基因植物表达载体的构建及遗传转化
• 4.1 毛竹 PAL1、CCoAOMT 和 CAD 基因植物表达载体的构建
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 试验方法
• 4.1.3 结果与分析
• 4.1.3.1 毛竹PAL1 基因植物表达载体的构建
• 4.1.3.2 毛竹CCoAOMT 和CAD 基因植物表达载体的构建
• 4.2 毛竹 PAL1、CCoAOMT、CAD 基因植物表达载体的遗传转化
• 4.2.1 试验材料
• 4.2.2 试验方法
• 4.2.2.1 根癌农杆菌介导的遗传转化和转基因植株再生
• 4.2.2.2 转化再生烟草的初步检测
• 4.2.3 结果与分析
• 4.3 小结
• 第五章 结论与讨论
• 5.1 结论
• 5.2 讨论
• 5.3 展望
• 参考文献
• 附录
• 在读期间的学术研究
• 致谢