一种耐高温SOD基因的克隆表达及其产物纯化和性质研究

论文摘要

本实验从一株地热芽孢杆菌（Geobacillus）的新菌株中获得一个耐高温超氧化物歧化酶基因（Superoxide Dismutase）,全长1236 bp,编码411个氨基酸残基,其编码的蛋白分子量预计为47.25 kD。在对其进行生物信息学的分析后,发现在366-373位氨基酸残基处有一个SOD蛋白保守序列,其他物种中SOD也含有DVWEHAYY。预测其三级结构具有9个α螺旋结构,3个呈栅栏状B折叠结构。为研究耐高温SOD蛋白的功能,将该基因的ORF克隆到表达载体pET-28a(+1的相应酶切位点,成功构建了原核表达载体pET-28a（+）-SOD,并转化感受态细胞E.coli BL21 （DE3）,经IPTG诱导表达后,收集菌体,对裂解菌体的上清和沉淀分别进行SDS-PAGE检测,上清样品电泳发现有一特异性条带,与预期蛋白分子量48.07 kD相符。裂解菌体高速离心后的上清经镍柱亲和层析纯化后,获得的目的蛋白纯度达90%。该重组蛋白在90℃条件下处N2h仍具有活性,通过不同温度条件处理重组蛋白,可除去大部分杂蛋白而不影响重组蛋白的活性,纯度可达70%左右。此外,将目的片段克隆到杆状病毒转座载体pFastBac HTB中,利用Bac to Bac系统,构建重组Bacmid-SOD。通过脂质体转染家蚕培养细胞BmN,获得重组病毒,经PCR鉴定结果表明重组病毒构建成功。将重组病毒感染BmN细胞,发病后经Western blot和WST一1法鉴定,结果表明耐高温SOD基因在BmN细胞中成功表达。比较这两种不同体系表达的耐高温SOD蛋白,最终确立了利用原核系统构建的工程菌来发酵生产耐高温SOD蛋白。此外,利用Cy5荧光素标记发酵生产的耐高温SOD蛋白,通过小动物活体成像系统观察外源SOD在BALB/c小鼠体内的生物学分布,结果发现该耐高温SOD蛋白主要富集在小鼠的肾脏,而在心脏、脾脏等其他器官未见明显富集,给药1 h后,肾脏仍有富集,其具体作用机制尚待进一步研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 超氧化物岐化酶的研究综述
• 引言
• 1 超氧化物歧化酶的概念
• 1.1 SOD的发现和命名
• 1.2 SOD的种类及分布
• 1.3 SOD的分子生物学
• 1.4 SOD的结构和性质
• 1.5 SOD的功能在各个领域中的应用
• 2 国内外SOD的研究概况
• 3 耐高温SOD的研究进展及意义
• 3.1 耐高温SOD的研究进展
• 3.2 耐高温SOD的研究意义
• 4 家蚕杆状病毒表达系统的研究
• 第二章 实验方案设计
• 1 研究目的和意义
• 2 研究内容
• 3 实验流程图
• 3.1 SOD蛋白在大肠杆菌系统中的表达与纯化
• 3.2 SOD发酵工艺
• 3.3 SOD蛋白在家蚕杆状病毒系统中的表达
• 第三章 生物信息学分析
• 1 序列与生物信息学工具
• 1.1 序列
• 1.2 生物信息学工具
• 2 方法
• 3 结果
• 3.1 耐高温SOD蛋白的基因序列
• 3.2 耐高温SOD蛋白的二级结构预测
• 3.3 耐高温SOD蛋白的高级结构预测
• 3.4 氨基酸序列的同源性分析
• 3.5 耐高温SOD蛋白的疏水性分析
• 3.6 耐高温SOD蛋白的跨膜区预测分析
• 3.7 耐高温SOD蛋白的信号肽分析
• 3.8 耐高温SOD蛋白的磷酸化位点预测分析
• 3.9 耐高温SOD蛋白的功能位点预测分析
• 3.10 耐高温SOD蛋白在细胞中定位的分析
• 4 讨论
• 第四章 耐高温SOD基因的克隆、原核表达与重组产物纯化
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 主要试剂的配制
• 1.4 主要试剂盒
• 2 方法
• 2.1 原核重组质粒的构建
• 2.2 重组质粒pET-28a-SOD在BL21（DE3）中表达
• 2.3 重组蛋白的纯化
• 2.4 BCA法蛋白定量
• 2.5 酶活测定
• 3 结果
• 3.1 PCR扩增目的片段
• 3.2 重组质粒pET-28a-SOD的双酶切鉴定
• 3.3 重组蛋白的诱导表达
• 3.4 亲和层析纯化重组蛋白
• 3.5 调节温度法纯化重组蛋白
• 3.6 不同的蛋白样品浓度测定及酶活测定结果
• 4 讨论
• 第五章 原核表达纯化的耐高温SOD蛋白相关性质研究
• 1 材料与试剂
• 1.1 质粒
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 耐高温SOD蛋白的相关性质研究
• 2.1 SOD酶活检测
• 2.2 重组超氧化物歧化酶的最适反应温度
• 2.3 重组超氧化物歧化酶的热稳定性
• 2.4 pH对重组超氧化物歧化酶活性的影响
• 2.5 存放时间稳定性
• 2.6 紫外吸收光谱测定
• 3 结果与分析
• 3.1 重组超氧化物歧化酶的最适温度
• 3.2 重组超氧化物歧化酶热稳定性
• 3.3 重组超氧化物歧化酶pH的稳定性
• 3.4 存放时间稳定性
• 3.5 紫外吸收光谱测定
• 4 讨论
• 第六章 发酵生产耐高温超氧化物歧化酶的研究
• 1 材料
• 1.1 菌株
• 1.2 培养基
• 1.3 试剂及试剂盒
• 1.4 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 摇瓶种子培养
• 2.2 摇瓶发酵条件优化
• 2.3 高密度发酵生产耐高温SOD蛋白工艺
• 3 结果
• 3.1 诱导时机
• 3.2 诱导剂浓度
• 3.3 发酵诱导后表达时间
• 3.4 高密度发酵培养过程中菌液吸光度值的测定
• 3.5 发酵诱导表达SOD蛋白过程中菌液吸光度值的测定
• 3.6 分离纯化获得耐高温SOD蛋白
• 4 讨论
• 第七章 家蚕杆状病毒系统表达耐高温的超氧化物岐化酶
• 1 材料与试剂
• 1.1 载体、菌株、细胞、培养基
• 1.2 其他试剂
• 1.3 主要试剂配制
• 1.4 试剂盒
• 2 方法
• 2.1 构建重组pFastBacHTB载体
• 2.2 重组pFastBacHTB质粒与穿梭载体Bacmid同源重组
• 2.3 重组病毒vBmHis-SOD的构建
• 2.4 重组病毒在家蚕细胞中传代培养
• 2.5 目的蛋白在BmN细胞中的表达及鉴定
• 2.6 在家蚕杆状病毒细胞中表达目的蛋白以及目的蛋白的活性测定
• 3 结果
• 3.1 重组pFastBacHTB载体鉴定
• 3.2 提取重组Bacmid DNA
• 3.3 重组Bacmid DNA鉴定
• 3.4 提取重组病毒并PCR鉴定
• 3.5 家蚕细胞中表达耐高温SOD蛋白的鉴定
• 3.6 家蚕细胞中表达耐高温SOD蛋白的活性鉴定
• 4 讨论
• 第八章 活体成像分析标记的重组SOD蛋白在小鼠体内的生物分布
• 1 材料与试剂
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要试剂和耗材
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢