论文摘要
背景及目的:中国是结核高疫情国家,是世界上22个结核病高负担国家之一,并且为耐药结核病疫情最严重的国家之一[1]。第四次全国结核病流行病学抽样调查显示全国结核发病率平均为367/10万人,而重庆地区为549/10万人,是结核病的高发地区,每年新发现4万结核病患者,是京津沪的10余倍,其原因目前尚不清楚。重庆是著名的山城,地理气候比较独特,其年日照量全国最低,紫外线照射严重不足。前期调查发现重庆地区63.16%的健康献血者与66.67%的骨关节结核患者存在维生素D缺乏。VD对免疫细胞的功能有着多方面的作用,体外研究表明VD既可增强巨噬细胞的吞噬能力,又可抑制DC细胞成熟,并影响T细胞的分化及功能[2]。（一）1 ,25 （OH） 2 D3及其衍生物具有增强天然免疫作用,研究表明VD缺乏与结核易感性密切相关,随着25（OH）D水平的升高,感染危险降低,潜伏感染发展为结核病的危险也降低[3]。在结核化疗前时代,光照疗法和营养疗法是治疗结核病的主要措施,经皮肤合成和饮食摄入增加了体内25 （OH） D和1 ,25 （OH） 2 D3水平,结核治愈率提高至约25%,抗结核药物发明后VD在结核病治疗中逐渐被淡忘。近年来,VD免疫调节作用研究的兴起、结核耐药与抗结核药物研发滞后的矛盾促使学者们重新重视VD在防治结核病中的应用[4]。重庆地区独特的地理和气候特点导致年日照量全国最低,紫外线照射不足而皮肤合成的VD较少,因贫困经饮食摄取VD不足,冬季VD缺乏较为普遍。VD与免疫系统的关系近年来受到广泛关注,通过黄光照射、去VD合成营养素饲料喂养建立的小鼠VD缺乏模型,免疫机制严重紊乱,表现为T细胞亚群分布失调、免疫耐受减弱而自体免疫损伤加重,T淋巴细胞亚群分布紊乱、功能下降（Th2抑制）,提示1 ,25 （OH） 2 D3在单核/巨噬细胞分化成熟中的重要意义,补充VD 8周后可恢复正常;因建立条件严格、耗时长,佝偻病研究中未被广泛采用,但该模型为研究环境因素导致VD缺乏对免疫系统影响的最理想模型。（二）1 ,25 （OH） 2 D3及其衍生物具有诱导免疫耐受减轻免疫自体损伤作用。1 ,25 （OH） 2 D3能够影响DCs生命周期中所有的主要阶段:阻碍单核细胞分化成DCs;阻止幼稚DCs向成熟DCs分化, MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子CD40、CD80、CD86表达下调,IL-12分泌减少,IL-10显著增加,从而诱导出具有致耐受性表型和功能的未成熟DCs,未成熟DCs与T淋巴细胞的耐受性相关。然而VD缺乏是否是结核的易感因素尚需要体内实验进一步证明。为研究VD缺乏在结核感染发病中的作用,我们首先建立了VD缺乏小鼠模型,然后用卡介菌刺激,观察体内的免疫变化与正常小鼠刺激后的差别。方法:1.维生素缺乏纯合成小鼠饲料的配制将双蒸水50L平均分装到容量为50L的金属桶装容器中,分别加入625g琼脂,在105℃加热40分钟,然后放入到60℃的保温箱中备用。将比例[3]称量的各种原料放入混合机中混合30min,后加入到无尘粉碎机中粉碎,全部一次性通过200钼筛。将其平均分成两份分别加入到琼脂溶液中,并加入脂溶性维生素溶液各250ml（一份含VD,一份未含）,充分搅拌30min,室温下冷却1h,然后放入到-20℃冰箱中冻存。2.维生素缺乏动物模型的建立及评价36只怀孕2周的BALB/C小鼠,分为三组。正常组喂正常饲料、VD+组喂VD+饲料、VD-组喂VD-饲料。VD-组遮光黄光灯照射。剔除雄性子鼠,入组的子鼠正常组18只、VD+组15只、VD-组13只,出生3周断奶,饲养环境及饮食同母鼠。测4-10周、12周子鼠体重,8、12周时测每天子鼠饮食消耗量,同时观察子鼠运动习性。12周时将上述三组子鼠剪尾取血100ul离心取血清测VD水平,每组随机取三只子鼠摘眼球取血,测白蛋白水平;将VD缺乏子鼠10只随机分为组I继续遮光+正常饮食,组II正常环境+正常饮食,6周后摘眼球取血测VD水平。3.VD缺乏子鼠体内免疫机能变化的检测尾静脉取血测VD后将上述三组子鼠每组取5只分别在其尾根部注射BCG（0.1mlBCG含卡介苗0.05mg）0.1ml,再饲养六周,饲养环境同前。刺激6周后分离血清,-70℃冻存待检;无菌分离脾淋巴细胞,调整浓度为5×106 cell/ml。取200μl脾淋巴细胞悬液,流式细胞仪检测CD4 +和CD8 +T细胞百分比。间接ELISA方法测定特异性IFN-γ和IL-10水平,及血清特异性抗体滴度。CCK-8检测脾淋巴细胞增殖情况,结果用刺激指数（Stimulation index,SI）表示,SI=A实验孔/A对照孔。如刺激指数<1,则用Annexin V-PI试剂盒检测是否凋亡。结果:1.正常组与VD+组体重无统计学差异（P>0.05）;VD+组、VD-组8周、12周日平均消耗饲料,经统计学分析8周时有差异,12周时无差异。2.正常组、VD+组、VD-组血浆白蛋白分别为33.2±1.04、32.4±0.53、32.8±0.67（g/L）,无统计学差异。3.正常组与VD+组血浆VD水平无显著差异,但VD-组血浆VD含量下降到正常的20%以下,提示小鼠VD缺乏模型建立成功;六周后,组I、组II VD水平分别为18.46±1.53、58.46±5.53（nmol/L）（P<0.001）。4.测子鼠血浆钙水平分别为2.32±0.087、2.49±0.144、1.73±0.091（mmol/L）,血浆磷水平分别为2.20±0.071、2.41±0.042、1.77±0.091（mmol/L）,经统计学分析三组之间血浆钙磷含量均有统计学差异（P<0.05）,正常组与VD+组无显著差异（P>0.05）,VD-组与另外两组均有显著差异（P<0.05）。5.BCG刺激正常组、VD+组及VD-组6周后,脾淋巴细胞中CD4+细胞亚群百分率分别为28.64±0.59、24.86±0.49、30.1±0.8, CD8+为10.9±0.72、9.42±0.55、14.14±0.83, CD4+/CD8+的比值分别为2.64±0.19、2.66±0.23、2.13±0.09,VD-组CD4+及CD8+淋巴细胞百分比均显著上升尤其以CD8+上升幅度更大。6.血浆IFN-γ分别为375.40±13.11、301.96±23.60、478.43±17.50（pg/ml）,血浆IL-10分别为27.35±2.81、28.55±0.72、21.47±1.34（pg/ml）,VD-组较其他两组血浆IFN-γ显著上调而IL-10显著下调。7.VD-组血清特异性抗TB-PPD抗体显著高于正常组及VD+组。8.三组脾淋巴细胞增值刺激指数分别为1.47±0.12、1.15±0.11、0.65±0.16,VD-抑制了脾脏T淋巴细胞在TB-PPD刺激下的增殖能力,其中VD-组淋巴细胞出现显著凋亡。结论:1.通过控制食物和光照,成功建立VD缺乏BALB/c小鼠动物模型。2.在VD的天然来源中,紫外线的作用较饮食作用重要,但直接补充VD效果显著。3.VD缺乏可引起一系列疾病,在本实验中出现佝偻病症状。4.VD缺乏显著改变了机体免疫系统对BCG刺激的应答特征,提示可能与VD缺乏容易引起结核病相关。5.VD在天然免疫中发挥重要病因学作用,同时增加免疫耐受,减轻自身免疫性损伤。这为临床治疗结核感染及自身免疫性疾病提供一条崭新的思路。