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苏云金杆菌cry1Ac基因与神经毒素基因hwtx-Ⅰ的融合克隆表达及其融合蛋白活性研究

2020-11-22阅读(679)

苏云金杆菌cry1Ac基因与神经毒素基因hwtx-Ⅰ的融合克隆表达及其融合蛋白活性研究

论文摘要

在苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）应用研究上,主要利用基因工程技术来构建更高毒力的重组蛋白和重组菌株,如定点突变研究,融合基因研究,转基因植物研究等方面的研究。为了构建更高毒力,杀虫谱更广的工程菌株,本研究利用crylAc基因和神经毒素基因hwtx-Ⅰ构建融合基因来提高晶体蛋白的杀虫毒力。 采用生物信息学方法比较crylAc基因序列的同源性,通过设计引物对Ac-F和Ac-R从Bt4.0718菌株质粒上扩增含有上游启动序列的crylAc基因的片段,然后用Bt菌株偏爱密码子优化设计虎纹毒素-Ⅰ基因（hwtx-Ⅰ）和肠激酶位点序列（Enterokinase site简称ErK site）,然后进行化学合成。对合成片段进行磷酸化退火连接,设计引物对Ltx-F和Ltx-R扩增完整的hwtx-Ⅰ和ErK site的片段。然后将这两个片段进行连接,用引物对Ac-F和Ltx-R扩增出融合基因片段,经一系列酶切和亚克隆,将带有上游启动序列和下游终止序列的融合基因片段克隆进穿梭载体pHT304中,获得表达载体pXL43。将表达载体pXL43分别电转化进无晶体突变株XBU001获得重组菌株XL002和野生型菌株Bt4.0718中获得重组菌株XL004。 经SDS-PAGE分析:融合基因在无晶体突变株中得到大量表达,蛋白质定量分析显示目的蛋白占总蛋白量的61.38%。将重组菌株XL002经发酵并纯化重组晶体蛋白,经原子力显微镜（Atomic Force Microscopy,AFM）观察显示:融合晶体蛋白呈有规则的菱型晶体,其大小约为1.0×2.0μm。生测结果显示:融合晶体对小菜蛾（Plutella xylostella）有高效杀虫活性,生测2d的Lc50值为5.12μg/ml。从融合晶体中提取20kb-DNA,并进行PCR鉴定,进一步证明晶体中20-kbDNA片段部分来自于质粒。还对重组菌株XL004进行了SDS-PAGE和生测分析,并对融合基因在重组菌株中表达进行了探讨。本研究通过成功构建crylAc基因和hwtx-Ⅰ基因的融合基因,为构建Btcry基因和其它外源毒素基因的融合基因以及构建高毒力的工程菌株奠定

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 引言
  • 1.苏云金芽孢杆菌概述
  • 2.苏云金芽孢杆菌毒素
  • 3.苏云金芽孢杆菌ICPs基因
  • 3.1 ICPs基因的存在模式
  • 3.2 ICPs基因的命名与分类
  • 3.3 cry基因的表达调空机制
  • 4.苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的作用机理
  • 4.1 晶体蛋白的结构
  • 4.2 晶体蛋白的作用机理和模型
  • 5.苏云金芽孢杆菌的研究应用现状
  • 5.1 抗性管理研究
  • 5.2 定点突变研究
  • 5.3 利用转座子构建重组质粒和重组菌株研究
  • 5.4 转cry基因植物的研究
  • 5.5 融合基因的研究
  • 6.关于虎纹毒素-Ⅰ的概述
  • 7.工程菌研究
  • 7.1 杀虫防病工程菌的构建
  • 7.2 延长残效期工程菌的构建
  • 7.3 杀虫固氮工程菌的构建
  • 7.4 延缓抗性工程菌的构建
  • 8.立题依据和意义
  • 材料与方法
  • 1.材料
  • 1.1 菌株与质粒
  • 1.2 培养基和抗生素
  • 1.3 试剂和引物
  • 1.4 供试昆虫
  • 1.5 仪器设备
  • 2.方法
  • 2.1 融合基因的构建
  • 2.2 融合基因表达载体的构建
  • 2.3 表达载体pXL43电转化无晶体突变株XBU001
  • 2.4 融合基因在无晶体突变株中的表达
  • 2.5 融合基因在Bt4.0718中的表达研究
  • 2.6 重组菌株XL004的生物活性测定
  • 结果与分析
  • 1.融合基因的构建
  • 1.1 Bt4.0718菌株质粒的抽提
  • 1.2 含有上游启动序列的crylAc基因的PCR扩增
  • 1.3 优化设计hwtx-1序列
  • 1.4 hwtx-1序列片段的磷酸化退火连接
  • 1.5 PCR扩增hwtx-1片段
  • 1.6 融合基因的PCR扩增
  • 2.融合基因表达载体构建
  • 2.1 中间重组质粒pUA19的构建
  • 2.2 中间重组质粒pUAH19的构建
  • 2.3 表达载体pXL43的构建
  • 2.4 融合基因片段上下游序列分析
  • 3.融合基因在无晶体突变株XBU001中的表达
  • 3.1 表达载体pXL43电转化无晶体突变株XBU001和鉴定
  • 3.2 融合蛋白的分离提取和SDS-PAGE检测
  • 3.3 重组晶体蛋白的AFM观察
  • 3.4 重组晶体蛋白的生测分析
  • 3.5 重组晶体蛋白中20kb-DNA的来源简要分析
  • 4.融合基因在Bt4.0718菌株的表达分析
  • 5.重组菌株XL004的生测分析
  • 讨论
  • 1.以crylAc基因为基础构建杀虫融合基因研究
  • 2.PCR扩增crylAc全长基因研究
  • 3.构建融合基因方法的探讨
  • 4.融合基因表达系统的构建策略
  • 5.融合蛋白形成晶体的研究
  • 6.融合蛋白的毒理研究
  • 7.重组菌株XL002晶体蛋白中20kb-DNA片段的来源初步分析
  • 8.重组质粒转化Bt4.0718菌株的表达探讨
  • 结语
  • 1.融合基因的克隆和表达
  • 2.工程菌株研究
  • 3.今后工作设想
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢
  • 原创性声明

    • 相关论文文献

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