论文摘要
[背景和目的]糖尿病（diabetes mellitus，DM）是多种因素相互作用导致的慢性流行病。目前已成为继心脑血管疾病和恶性肿瘤之后的第三大死亡原因，其危害性主要表现在慢性并发症导致的高致死率、高致残率。糖尿病慢性并发症主要包括大、中血管病变和微血管病变。糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）作为糖尿病的主要慢性并发症之一，正随着糖尿病的患病率增加而逐年上升。在发达国家，DN已成为终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）的主要原因，迄今为止其发病机制仍在探索之中。DN的主要病理改变是基底膜增厚及肾小球和肾小管间质细胞外基质生成过多和过度积聚。大量体内和体外实验证明，在这一病理过程中，炎症起着十分重要的作用。DM患者存在高血糖、血流动力学障碍等均可损伤肾脏固有细胞，细胞损伤后释放前炎症介质，趋化白细胞到损伤部位并活化，如果损伤去除，炎症被限制，则白细胞局限在损伤部位。单核-巨噬细胞可通过释放肿瘤坏死因子（TNF-α）、血小板源性生长因子（PDGF）等细胞因子及分泌细胞外基质加剧炎症反应，刺激肾小球系膜细胞（mesangial cell，MC）分泌Ⅳ型胶原（typeⅣcollagen，CO-Ⅳ）、层粘连蛋白（laminin，LN）、纤维粘连蛋白等导致肾小球硬化。肾小球损伤后蛋白滤出增加及滤出的前免疫介质还可刺激肾小管上皮细胞，肾小管上皮细胞也能分泌免疫介质，细胞因子，使肾间质单核-巨噬细胞聚集，原基质成纤维细胞和经上皮间叶转化来的肌纤维细胞增殖，导致间质纤维化。白细胞介素-18（interleukin-18，IL-18）是一种多效性细胞因子，主要有单核-巨噬细胞分泌，结构和IL-1β相似而功能和IL-12相仿。由于其能诱导Th1等细胞产生IFN-γ，最初被命名为IFN-γ诱导因子（IGIF）。鉴于其的氨基酸序列与已知数据库中的任何蛋白质均不相同，命名为IL-18。IL-18除了能诱导多种细胞产生IFN-γ外，还能诱导免疫细胞产生细胞因子，促进免疫细胞表达FasL、增强Fas介导的细胞毒作用等多种生物学功能。此外，核转录因子-κB（NF-κB）信号途径也参与IL-18激活的信号传导，NF-κB是重要的核转录因子，激活的关键在于抑制性蛋白IκB的磷酸化和降解，NF-κB活化后，NF-κB P65由胞浆转位于胞核中与相应DNA序列结合，上调相应基因的表达。近年来发现IL-18与原发性肾小球疾病、狼疮性肾炎、慢性肾衰竭、急性肾衰竭等多种肾脏疾病的发生发展密切相关。最近研究表明，在T2DM患者的血浆和尿液中均有IL-18升高，并随T2DM的病程和肾脏病变的不断进展，血浆中和尿液中IL-18的含量成高度正相关。刘华锋等用免疫组织化学方法检测原发性肾病综合征患者和原发性肾小球肾炎患者的肾组织发现，在膜增生性肾小球肾炎和系膜增生性肾小球肾炎中均有较高的IL-18表达量。国外研究也表明，糖尿病患者的血清中IL-18显著升高，并和尿白蛋白排泄率（UAER）、糖化血红蛋白（HbAlc）、超敏C反应蛋白和尿β2微球蛋白呈正相关。都提示IL-18在糖尿病肾病发生发展过程中可能起到重要作用，并和炎症反应有关。本研究在体外进行MC原代培养，在高糖环境下以外源性IL-18刺激MC，旨在观察不同浓度的外源性IL-18对MC增殖、分泌CO-Ⅳ、LN和表达肿瘤坏死因子（TNF）-α的影响，并进一步观察了抗氧化剂吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（PDTC）对其影响作用，了解IL-18在DN发生机制中的作用和PDTC对其抑制作用，为进一步研究以IL-18或NF-κB作为靶点治疗DN提供实验依据。[方法]本研究通过体外原代培养MC，观察IL-18和PDTC对MC增殖、分泌CO-Ⅳ、LN和表达TNF-α的影响，并对其机制进行了初步观察。实验对象分为IL-18组和IL-18+PDTC组，其中IL-18组包括A（0μg/L）、B（25μg/L）、C（50μg/L）三个不同浓度亚组，A组为对照组；IL-18+PDTC组包括D、E、F三个亚组，即在IL-18组的基础上加入100μmol/L的PDTC，以上各组均以不同浓度IL-18或PDTC作用MC48小时，培养液为33.3mmol/L的MEM培养液。分别采用（1）MTT摄入法检测MC的增殖情况；（2）ELISA检测培养上清中MC分泌CO-Ⅳ、LN的情况；（3）RT-PCR法检测TNF-α在MC内的表达水平以及（4）免疫细胞化学方法检测核转录因子-κB（NF-κB）的激活情况。[结果]1．原代培养MC，消化接种的肾小球残体第3～5天有50％～60％贴壁，第7天可见细胞移出，此后，肾小球残体大部分瓦解，结构消失。肾小球系膜细胞占优势，上皮细胞基本消失，3～4周后，系膜细胞长满瓶底，此时可进行传代。传代培养的系膜细胞24小时内全部贴壁，生长迅速，7～10天长满瓶底，倒置显微镜下观察MC呈梭形或星形，细胞核呈圆形或卵圆形，胞质向外伸出较多长短不一的突起。免疫细胞化学SP法鉴定培养的细胞抗结蛋白、抗α-平滑肌肌动蛋白单抗染色阳性，抗细胞角蛋白、抗Ⅷ因子相关抗原单抗染色阴性。表明培养的细胞为肾小球系膜细胞。2．25μg/L、50μg/L的IL-18作用组的吸光度（A）值均高于对照组（P＜0.01），且50μg/L组明显高于25μg/L组（P＜0.01），提示IL-18能明显诱导MC增殖；D组与A组相比，两组的A值差别无统计学意义（P＞0.05）而E组低于B组（P＜0.01），F组低于C组（P＜0.01），提示PDTC能抑制IL-18诱导的MC增殖。3．在单纯IL-18作用组中，随着IL-18浓度的升高，上清液中CO-Ⅳ的含量逐渐增多，与对照组相比较，差异有统计学意义（P＜0.01），50μg/L组与25μg/L组相比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；25μg/L、50μg/L两组与对照组相比较，上清液中LN的含量差别亦有统计学意义（P＜0.01），但25μg/L、50μg/L两组之间相比较，差别无统计学意义（P＞0.05）；提示IL-18能诱导系膜细胞分泌CO-Ⅳ和LN。D组与A组相比差别无统计学意义（P＞0.05）。E组低于B组，F组低于C组，差别均具有统计学意义（P＜0.01），提示100μmol/L的PDTC能明显抑制IL-18诱导系膜细胞分泌CO-Ⅳ和LN。4．在8％FCS高糖MEM条件下，大鼠MC无基础TNF-αmRNA表达，对照组和D组，均无TNF-αmRNA表达（灰度值为0）。25μg/L组及50μg/L组培养MC 48h后均有TNF-αmRNA表达，与对照组相比较差别有统计学意义（P＜0.01），且后者明显高于前者（P＜0.01），说明IL-18能诱导MC表达TNF-αmRNA。IL-18处理组加PDTC后TNF-αmRNA表达量显著下降（P＜0.01），表明PDTC能明显抑制IL-18诱导的TNF-αmRNA表达。5．采用免疫细胞化学SP法检测NF-κB P65的表达情况，镜下NF-κB P65阳性细胞以细胞核染色为主，间有细胞浆染色，NF-κB P65阴性细胞则以细胞浆染色为主，间有细胞核染色，呈棕黄色，并可见棕黄色颗粒沉积。对照组和D组细胞核内NF-κB p65表达阴性；25μg/L组及50μg/L组与对照组比较，细胞核内NF-κB p65表达明显增加，大量MC核着色；IL-18+PDTC组与IL-18组相比较，细胞核内NF-κBp65表达明显减弱，核着色大大减少，而胞浆着色增多。[结论]1．高糖环境下，不同浓度的IL-18可明显诱导MC增殖，并随浓度增加，MC增殖明显增强，PDTC能抑制IL-18诱导的MC增殖。2．体外高糖环境下，IL-18可诱导MC分泌CO-Ⅳ、LN，且PDTC能强烈抑制这一过程。3．不同浓度的IL-18可促使体外高糖环境下培养的MC内表达TNF-α，并可被PDTC强烈抑制。4．IL-18可活化NF-κB P65，使其由胞浆向胞核内转移，PDTC可使这一过程减弱。5．IL-18可能通过NF-κB激活途径影响MC增殖、分泌CO-Ⅳ、LN和TNF-α的表达而参与DN的发生、发展，抗氧化剂PDTC能强烈抑制这一过程。
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