论文摘要
人乳铁蛋白（human lactoferrin）又称乳转铁蛋白,是人乳汁中主要的铁结合蛋白,具有抑菌、增强免疫等多种生物学功能。本研究应用人乳铁蛋白（cDNA）基因与牛α-S1-casein或山羊β-casein调控序列分别构建的表达载体制备转基因小鼠,从而检验表达载体在原代及后代转基因小鼠中乳腺特异性遗传与表达的特性,以及表达产物（rhLF）的抑菌活性,为后续山羊人乳铁蛋白乳腺生物反应器的制备提供实验依据。分别用牛α-S1-casein或山羊β-casein调控序列和人乳铁蛋白cDNA功能基因构建了AP与PCL25两个乳腺特性表达载体,通过显微注射法制备转基因小鼠,分别获得2♀与1♀原代转基因小鼠。原代转基因小鼠与ICR或C57交配,出生后代经PCR检测,筛选出F1代转基因小鼠,再从F1代中随机选取2-3只阳性整合小鼠与ICR或C57交配,得F2代,依次反复得到F3、F4代转基因小鼠;将AP与PCL25的原代转基因小鼠以及F1、F2代转基因小鼠,通过近交或回交方法繁殖,用测交法和PCR整合检测筛选出纯合子转基因小鼠。分别收集AP与PCL25转基因小鼠乳汁,离心去除脂肪和酸化沉淀去除酪蛋白,获得小鼠乳清。用标准hLF为参照,经ELISA定量表达产物;Western-blot进一步分析表达的rhLF大小,并通过透析与凝胶过滤层析提取rhLF;再用所得的rhLF对大肠杆菌和沙门氏菌进行抑菌试验。结果显示,AP构件的F1代转基因小鼠的整合率为57.14%（12/21只）, F2代中阳性整合率为50%（10/20只）,F3代中阳性整合率为50%（17/34只）,F4代中阳性整合率为53.33%（24/45只）;PCL25构件的F1代转基因小鼠的整合率为53.85% （14/26只）,F2代中阳性整合率为39.58%（19/48只）,F3代中阳性整合率为31.11% （14/45只）,F4代中阳性整合率为38%（19/50只）。通过ELISA检测各代转基因母鼠乳汁中rhLF的含量,结果表明,AP与PCL25构件的后代转基因小鼠,其表达量与原代（3.61 g·L-1、6.4 g·L-1）相比,有上升也有降低,统计学分析无显著性差异（P>0.05）。获得AP构件的纯合子转基因小鼠2只（1♂1♀）,其母鼠乳汁中rhLF表达量为5.65 g·L-1;PCL25构件的纯合子转基因小鼠1只（1♀）,表达含量为5.98 g·L-1。它们乳汁中的rhLF含量明显高于杂合子转基因小鼠乳汁中的含量。采用ELISA和Western-Blot对提取的rhLF进行免疫检测,结果显示,AP与PCL25都有与标准hLF相一致的条带（约78kDa）,其浓度分别为7.52g·L-1、8.04g·L-1;分别用不同浓度的rhLF对大肠杆菌、沙门氏菌进行抑菌试验,从抑菌率和抑菌圈的大小,可以看出由AP与PCL25构件制备的转基因小鼠乳汁中的rhLF都具有抑菌活性,并随着浓度的增加而增强。通过本研究初步表明,我们所构建的AP与PCL25表达载体不仅能够指导人乳铁蛋白基因在原代小鼠乳腺中高效表达,并能够在后代中稳定的遗传和表达;且表达的rhLF具有抑菌活性。另外,转基因纯合子小鼠的筛选结果,这些都为我们下一步建立高效表达的人乳铁蛋白转基因山羊乳腺生物反应器奠定了基础。
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相关论文文献
- [1].利用挪威棕色大鼠致敏模型评价重组人乳铁蛋白(rhLF)的致敏性[J]. 农业生物技术学报 2013(12)
- [2].含重组人乳铁蛋白(rhLF)的转基因克隆牛奶粉喂养SD大鼠90天的安全性研究[J]. 农业生物技术学报 2013(12)
- [3].重组人乳铁蛋白(rhLF)的致敏性评价[J]. 农业生物技术学报 2013(12)