鹿茸多肽提取分离纯化及免疫活性的初步研究

论文摘要

鹿茸是绝大多数雄性鹿科动物所生长的一种尚未骨化的幼角,作为中药在我国已有两千多年的历史。鹿茸作为一种特殊的软骨组织,是一个天然的富含多种活性因子的细胞因子库,在其自体生长过程中,成骨、造血、神经生长、纤维细胞、上皮细胞生长同步进行、作为鹿体最活跃的生长点在其骨化之前贮存大量的生长因子,它们是鹿茸临床作用的生物化学基础,现代医学研究表明鹿茸具有广泛的药理学活性。但是鹿茸的促生长、促代谢、抗炎、免疫调节、健脑益智、抗衰老、生血、促进伤口及骨折愈合的药理作用是目前已知化学成分所无法解释的。因此,对鹿茸富含调控上述各器官组织发育成长的各种多肽类细胞生长因子的研究是十分有意义的。随着国家对中药现代化的逐步重视,我们选择了鹿茸多肽对细胞免疫的调节作用进行了研究。一、鹿茸多肽的提取分离纯化和含量测定鹿茸干片,小心切去边缘绒毛,加入70%乙醇,4℃浸泡48小时,16000RPM高速离心取上清液。经Superdex-75凝胶低压层析,20%乙醇洗脱,在280nm紫外光谱下可见6个独立的蛋白质吸收峰,分批收集洗脱液,得到6个组分,分别为标注为组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ。二、鹿茸多肽对小白鼠免疫功能的影响本研究观察了鹿茸多肽不同组分对小鼠外周血血清白介素-2含量、脾脏T淋巴细胞增殖反应、脾脏NK细胞杀伤活性和腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响,并尝试衡量鹿茸多肽的免疫活性作用。结果显示:组分Ⅲ、Ⅳ和混合多肽组可以显著提高小鼠外周血中IL-2的含量、在体内应用能极显著协同ConA刺激脾脏淋巴细胞增殖以及可以显著提高小白鼠脾脏NK细胞的杀伤活性,并且达到了差异极显著的水平（p<0.01）,活性最强的是组分Ⅳ,但是组分Ⅳ与组分Ⅲ和粗提物之间差异不显著（p>0.05）;通过腹腔巨噬细胞吞噬中性红实验可知,组分Ⅲ、Ⅳ和粗提物可以显著提高小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能（p<0.01）,活性最强的是粗提物,但是粗提物与组分Ⅲ和Ⅳ之间差异不显著（p>0.05）。在不同剂量鹿茸多肽对小鼠免疫功能影响的实验中发现存在剂量与免疫调节作用存在一定的相关关系,即随着浓度的增加作用效果增强,但是统计结果差异不显著。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 1. 鹿茸的研究进展
• 1.1 鹿茸的化学成分
• 2 鹿茸及其生物活性成分的药理学研究进展
• 2.1 增强机体免疫功能
• 2.2 促进创伤修复
• 2.3 抗氧化和抗衰老作用
• 2.4 抑制单胺氧化酶（MAO）活性
• 2.5 对中枢神经系统的作用
• 2.6 对性功能的影响
• 2.7 促进RNA 和蛋白质的合成
• 2.8 对心血管系统的影响
• 2.9 抗肿瘤作用
• 3 细胞免疫反应检测方法的研究进展
• 3.1 白细胞介素-2 检测方法
• 3.1.1 应用放射性免疫检测技术检测IL-2
• 3.1.2 酶联免疫检测技术检测IL-2
• 3.1.3 半定量 RT-PCR 法检测 IL-2
• 3.2 淋巴细胞转化检测方法
• 3.2.1 3H-TdR 掺入法
• 3.2.2 MTT 比色法
• 3.2.3 特异性T 淋巴细胞反应的检测
• 3.2.4 细胞毒性T 淋巴细胞的免疫功能检测
• 3.3 先天性免疫细胞的检测
• 3.3.1 NK 细胞的检测
• 3.3.1.1 形态法
• 3.3.1.2 酶释法
• 3.3.1.3 荧光法
• 3.3.1.4 化学发光法
• 3.3.2 巨噬细胞的检测
• 3.3.2.1 利用炭粒廓清检验
• 3.3.2.2 吞噬功能的检测
• 3.3.2.3 巨噬细胞表面受体的检测
• 3.3.2.4 巨噬细胞溶酶体酶的测定
• 3.3.2.5 巨噬细胞促凝血活性测定
• 4. 本试验的目的和意义
• 试验一 鹿茸多肽的提取分离纯化
• 1 材料
• 1.1 鹿茸干片
• 1.2 主要仪器
• 2 鹿茸多肽的制备方法
• 2.1 鹿茸多肽的提取
• 2.2 凝胶层析的简介及原理
• 2.3 Superdex-75 凝胶层析柱分离提纯的操作方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 试验二 用Tricine-SDS-PAGE 初步鉴定鹿茸多肽
• 1 材料
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器
• 2 方法
• 2.1 SDS-PAGE 电泳法基本原理
• 2.2 Tricine—SDS—PAGE 蛋白质电泳溶液的制备
• 2.2.1 阳极缓冲液的制备
• 2.2.2 阴极缓冲液的制备
• 2.2.3 胶缓冲液的制备
• 2.2.4 丙烯酰胺贮存液的配制
• 2.2.4.1 3C 丙烯酰胺贮存液的制备
• 2.2.4.2 6C 丙烯酰胺贮存液的制备
• 2.2.5 样品缓冲液的制备
• 2.2.6 染色液的制备
• 2.2.7 脱色液的制备
• 2.2.8 灌胶
• 2.2.9 上样与电泳
• 2.2.10 染色、脱色和胶的保存
• 3 结果
• 4 讨论
• 试验三 考马斯亮蓝G -250 法测定鹿茸多肽的蛋白质含量
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 原理
• 2.2 蛋白质标准溶液的制备
• 2.3 马斯亮蓝G - 250 溶液的制备
• 2.4 标准曲线绘制
• 3 结果
• 4 讨论
• 试验四 鹿茸混合多肽对环磷酰胺诱导的免疫功能低下的小鼠血液指标的影响
• 1 试验材料
• 1.1 试验动物
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器设备
• 2 试验方法
• 2.1 小鼠分组与处理
• 2.2 小鼠抗凝血的制备
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 试验五 鹿茸多肽对小鼠外周血血清白介素-2 含量的影响
• 1 试验材料
• 1.1 试验动物
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器设备
• 2 试验方法
• 2.1 小鼠分组与处理
• 2.2 小鼠血清的制备
• 2.3 小鼠血清中IL-2 含量的测定
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 试验六 鹿茸多肽对小鼠脾脏T 淋巴细胞增殖反应的影响
• 1 试验材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 主要试剂的配制
• 2 试验方法
• 2.1 MTT 比色法基本原理
• 2.2 试验设计与处理
• 2.3 脾脏淋巴细胞的分离
• 2.4 脾脏淋巴细胞转化率的测定
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 试验七 鹿茸多肽对小鼠脾脏NK 细胞活性的影响
• 1 试验材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 主要试剂的配制
• 2 实验方法
• 2.1 试验设计与处理
• 2.2 脾脏NK 细胞的制备
• 2.3 NK 细胞杀伤活性检测采用MTT 检测方法
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 试验八 鹿茸多肽对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
• 1 试验材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 主要试剂的配制
• 2 实验方法
• 2.1 试验设计与处理
• 2.2 腹腔巨噬细胞的制备
• 2.3 腹腔巨噬细胞吞噬中性红实验
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介
• 攻读学位期间发表的论文
• 附图