Patatin启动子驱动的马铃薯GBSSⅠ基因ihpRNAi植物表达载体的构建及转化马铃薯的研究

论文摘要

淀粉是仅次于纤维素的第二大碳水化合物。马铃薯（Solanum tuberosum L.）块茎中约含17%的淀粉,是生产淀粉的适宜作物,其淀粉已成为食品和工业的重要原料。淀粉由支链和直链淀粉构成,高支链淀粉具有较好的稳定性、溶解性、粘滞性和透明性,适于作增稠预制剂、乳化剂、粘着剂等;工业方面广泛用于胶带和粘合剂,在造纸、纺织、建筑、石油化工等工业也有广泛用途;高直链淀粉水溶性很低,分子间易结合,易发生凝沉,较难糊化而易老化,具有近似纤维的性能,是产生生物可降解塑料薄膜的潜在原料。因此,培育出含有高支链淀粉或高直链淀粉的马铃薯品种具有重要意义。已有的研究表明,控制淀粉生物合成的关键酶是ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、淀粉合成酶、淀粉分支酶和淀粉脱分支酶,利用基因工程技术对其进行调控,可定向改变淀粉含量和组成,特别是利用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术,可显著影响目标靶基因的表达,从而改变直链和支链淀粉的含量及其比值。本研究依照RNAi表达原理,选取马铃薯块茎中控制直链淀粉合成的关键酶—颗粒结合型淀粉合成酶（Granule-bound starch synthaseⅠ,GBSSⅠ）的一段保守序列（772-1313）作为靶标,构建含该序列的正义片段（gbss A）-内含子-反义片段（gbss B）的ihpRNAi植物表达载体,利用农杆菌介导法将其转入马铃薯中,以期实现GBSSⅠ基因的沉默,获得低或无直链淀粉含量的马铃薯新型种质资源。已取得的研究结果如下:1.克隆到马铃薯的GBSSⅠ基因的核心保守序列。测序结果表明,gbss A序列为542bp,该序列与GenBank中已公布的GBSSⅠ（Genbank NO.X58453）保守序列的同源性为99.82%;gbss B序列为542bp,其与GBSSⅠ保守序列的同源性为100%。2.克隆到马铃薯VP1-ABI3-like protein基因的内含子片段。测序结果表明,该片段为237bp,与GenBank中公布的该基因（Genbank NO. AJ309218）内含子序列的同源性达100%。3.构建了ihpRNAi中间载体,即pSKgABI载体。该载体含有三组酶切位点:BamHⅠ和PstⅠ、PstⅠ和HindⅢ、XhoⅠ和HindⅢ,分别用于gbss A、内含子和gbss B剪切和连接。4.patatin启动子的连接。利用patatin启动子替换掉表达载体pBI121g-35S的35S启动子,命名为pBI121g-P。5.构建了patatin启动子驱动ihpRNAi的植物表达载体,即pBI121g-PgABI。并将其导入根癌农杆菌LBA4404,获得了携带pBI121g-PgABI质粒的工程菌。6.工程菌转化马铃薯,获得转基因抗性植株。选用“陇薯3号”茎段和试管薯薯片、“甘农薯2号”试管薯薯片作为外植体,以MS为基本培养基,添加不同种类激素,构成“陇薯3号”茎段和试管薯薄片的6种分化培养基;选用MS+1.00mg/LIAA+0.20mg/LGA3+2.00mg/LZT+0.50mg/L6-BA作为“甘农薯2号”试管薯薄片分化培养基。结果发现,“甘农薯2号”试管薯薄片获得了36.5%的抗性芽分化率,61%的抗性芽生根率;“陇薯3号”茎段和试管薯薯片表现出絮状蓬松,未获得抗性芽。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 第一章 文献综述
• 1.1 马铃薯淀粉特性及应用
• 1.1.1 马铃薯淀粉特性
• 1.1.2 马铃薯淀粉的用途
• 1.2 植物淀粉合成及其基因工程改良
• 1.2.1 淀粉的结构
• 1.2.2 淀粉生物合成途径
• 1.2.3 淀粉生物合成关键酶的研究进展
• 1.2.4 基因工程改良淀粉品质
• 1.3 RNA 干扰
• 1.3.1 转录后基因沉默现象的发现及定义
• 1.3.2 转录后基因沉默现象的作用机制
• 1.3.3 RNAi 作用特点
• 1.3.4 RNAi 技术的发展
• 1.3.5 RNAi 在淀粉品质改良中的应用
• 1.3.6 RNAi 技术存在的问题
• 1.4 本研究的目的及意义
• 1.5 技术路线
• 第二章 patatin 启动子驱动的马铃薯19GBSSⅠ基因ihpRNAi 植物表达载体的构建
• 2.1 材料及方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 马铃薯GBSSⅠ基因正反义片段的克隆
• 2.2.2 马铃薯VP1 intron 的克隆
• 2.2.3 ihpRNAi 植物表达载体的构建
• 2.2.4 植物表达载体pBI121g-PgABI 转化根癌农杆菌
• 2.3 讨论
• 2.3.1 关于ihpRNAi 载体靶基因反向重复片段的长度选择
• 2.3.2 内含子的应用
• 2.3.3 关于启动子使用策略
• 第三章 根癌农杆菌介导的马铃薯GBSSⅠ基因ihpRNAi载体转化马铃薯的研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 “陇薯3 号”转化结果分析
• 3.2.2 “甘农薯2 号”转基因马铃薯植株的再生
• 3.2.3 转化植株的PCR 结果预测
• 3.3 讨论
• 第四章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介
• 导师简介