水稻紫黑色颖壳Pbh基因的遗传分析与克隆

论文摘要

本研究利用一个天然的水稻紫黑壳突变体pbh为材料,对成熟时期颖壳中色素的成分和含量进行了初步分析,并通过图位克隆、荧光定量PCR等方法分析和研究了调控紫黑色颖壳基因以及类黄酮代谢途径相关基因在水稻颖壳中的表达情况,主要研究结果如下:1.紫黑壳突变体（pbh）来源于大田种植的05261和9311杂交组合的高后代群体,是一天然的自发突变体。该突变体在种子蜡熟期后（开花后20天）颖壳变成紫黑色,之前保持绿色。正在成熟的穗子呈现顶部紫黑色和基部绿色的混合色,到种子完熟期以后所有饱满的种子完全变成紫黑色颖壳且易落粒。我们利用紫黑色突变体与颖壳颜色正常品种巴利拉杂交（pbh×Ballila）,构建遗传群体。通过遗传分析发现紫黑壳突变体性状受单显性基因控制,此外调查发现在材料中还存在调控种子果皮颜色的基因,但与紫黑色颖壳基因不连锁,两个性状可以看作是相互独立的基因来分别进行研究。而且所有的分离世代中的紫黑壳表型的单株都极易落粒,我们推测在突变体中落粒性状与紫黑色颖壳性状可能紧密连锁,或是由同一个基因决定的多种性状。与野生型相比,除了紫黑壳突变体穗长略长,千粒重有所增加外,其他农艺性状没有显著差别。2.利用紫外分光光度计法和高效液相色谱法测定野生型和突变体成熟期水稻颖壳中的花青素和原花青素含量和成分的结果表明,与黄壳野生型材料相比,紫黑色颖壳突变体中可溶性的原花青素含量明显下降,而不可溶的原花青素水解后产生的花青素含量和成分没有显著差别。以原花青素的两个单体儿茶素和表儿茶素为标准品,用反相HPLC测定可溶性原花青素结果表明,紫黑壳突变体中几乎不含有表儿茶素或含量极少未检测出,其它可能属于原花青素多聚体成分,在同等检测条件下,峰图面积也显著变少,表明原花青素的总含量明显减少。3.利用（pbh×Ballila）的F2和F3群体将显性紫黑壳基因精细定位在第4染色体长臂端64.9Kb区间内。该区间共有12个ORF,通过对该区段测序发现,ORF1（multidrug resistance protein,命名为OsMRP）的第10外显子处有一单碱基的突变C→T,造成第1022位的缬氨酸（V）变成异亮氨酸（I）;此外,ORF11（amino acid transporter family,命名为Bh4-5）的外显子中有22bp碱基的插入,与最近发表的Bh4基因为等位基因。为了确定控制紫黑色颖壳性状的基因,我们分别构建了OsMRP和Bh4-5两个基因的互补载体、过表达载体和干扰载体。但由于实验材料（亲本紫黑壳突变体和黄壳野生型）的愈伤组织易褐化,继代能力低而难于实行遗传转化,尚未得到以黄壳野生型为受体材料的互补和过表达单株;以紫黑壳突变体为受体材料的干扰单株。仅得到了以丽江新团黑谷、日本晴、kitaaki为受体材料的干扰植株,相关的实验正在进行中。4.利用荧光定量PCR方法检测了OsMRP和Bh4-5两个基因的组织特异性表达结果表明,OsMRP在水稻苗期和成熟期均有表达,而且在成熟期的叶和穗部中,突变体的表达显著高于野生型。而Bh4-5基因在成熟期的穗部组织表达明显高于其他组织,且突变体中表达量高于野生型。5.通过对类黄酮途径相关的基因表达分析的发现,调控类黄酮物质生物合成的关键结构基因OsCHS、OsCHI、OsDFR、OsF3H、OsF3’H、OsGT在成熟期紫黑壳突变体各个组织中表达上调;参与类黄酮转运途径中的基因OsGST、OsAHA10、OsMATE主要是在紫黑颖壳突变体中高表达,但是同一基因在植株的局部组织（叶片或茎）中又以野生型的表达量较高;基因OsFLS、OsLAC和OsLAR在苗期的野生型与突变体中表达差异不明显,在成熟期突变体的叶中OsFLS、OsLAR高于突变体,而茎中却低于野生型。OsPAL在野生型和突变体中各个组织或时期表达量都很高,但是差异不显著,说明这个基因可能没有受到突变基因的影响。而调控原花青素前体表儿茶素的合成的OsANR基因在黄壳野生型各个组织的表达都显著高于紫黑壳突变体。这些结果显示在紫黑壳突变体的原花青素途径中的主要基因的表达都受到了影响,因此我们推测紫黑壳突变体可能是一个类黄酮代谢途径的一个突变体。6.分析成熟期的水稻颖壳中类黄酮途径相关基因表达情况发现,与野生型相比,大部分类黄酮途径相关基因OsDFR、OsMRP、OsCHS、OsF3H、OsF3’H、OsAHA10、OsANS、OsGT、OsGST在突变体壳中表达上调,OsPAL、OsMATE、OsCHI、OsLAC和OsFLS这几个基因在野生型和突变体中表达差异不明显。而与原花青素合成途径相关的两个基因OsLAC和OsANR的表达水平有所下调,该结果与分组织进行表达的研究结果基本一致。因此,我们推测突变的基因可能正向调控类黄酮途径的基因在颖壳中的相关表达,而负调控原花青素合成相关的两个基因。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 植物类黄酮的研究进展
• 1.1.1 植物类黄酮的基本结构和分类
• 1.1.2 植物类黄酮的生物合成途径
• 1.1.3 植物类黄酮生物合成途径的结构基因
• 1.1.4 植物类黄酮生物合成途径的调控基因
• 1.1.5 植物类黄酮物质的转运
• 1.1.6 类黄酮参与其它的生理代谢途径及生理学意义
• 1.2 类黄酮在拟南芥中的研究进展
• 1.3 水稻类黄酮研究进展
• 1.3.1 水稻中类黄酮的分布
• 1.3.2 水稻类黄酮以及色素基因的克隆
• 1.4 水稻有色颖壳突变体相关研究进展
• 1.5 本研究的目的和意义
• 第二章 水稻紫黑壳突变体的表型与遗传分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 田间试验
• 2.1.3 群体分离情况及野生型与突变体农艺性状的调查
• 2.1.4 水稻紫黑壳突变体与野生型色素组分的检测
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 紫黑壳突变体的表型特征
• 2.2.3 颖壳色素成分的检测
• 2.3 讨论
• 第三章 水稻紫黑色颖壳基因的图位克隆
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 水稻叶片DNA 的提取
• 3.1.3 分子标记（SSR、InDel、CAPs 和dCAPs）标记开发
• 3.1.4 分子标记的分析
• 3.1.5 紫黑色颖壳突变体基因的初定位
• 3.1.6 精确定位区间内候选基因的预测和候选基因的序列分析
• 3.2 结果
• 3.2.1 水稻紫黑色颖壳突变基因的初定位
• 3.2.2 水稻紫黑色颖壳突变体基因的精细定位
• 3.2.3 定位区间候选基因预测以及分析
• 3.3 讨论
• 第四章 候选基因的初步分析与类黄酮合成途径相关基因的表达分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 试剂、质粒和菌株
• 4.1.3 候选基因结构及同源性分析
• 4.1.4 候选基因植物转化载体的构建
• 4.1.5 水稻遗传转化和转基因阳性植株的验证
• 4.1.6 候选基因以及类黄酮途径相关基因的表达分析
• 4.2 结果
• 4.2.1 候选基因结构及相关生物信息学分析
• 4.2.2 候选基因的表达分析
• 4.2.3 类黄酮途径关键基因的表达分析
• 4.3 讨论
• 第五章 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介