鱼类CD4分子研究及Treg细胞亚群鉴定分析

论文摘要

CD4是重要的淋巴细胞表面分子,在高等脊椎动物T细胞的发育和活化过程中发挥重要作用。我们从黑青斑河豚（Tetraodon nigroviridis）及斑马鱼（Daniorerio）中获得了多种CD4样（CD4-like）分子,其中包括与高等动物类似的含4个Ig结构域的CD4-4分子和鱼类特异的含2个Ig结构的CD4-2分子。与高等动物CD4分子相比,二者均具有保守的胞外Ig样结构域及胞内的酪氨酸激酶p56lck结合位点。我们发现,鱼类的CD4阳性T细胞主要可以分为2类:CD4-2-CD4-4+和CD4-2+CD4-4+T细胞,且仅有后者能在促有丝分裂原刺激下增殖,并受IL-16特异性趋化。生物信息学分析发现,作为已知的高等脊椎动物CD4分子配体,IL-16和MHC-II与原始的CD4-2分子,而非CD4-4分子间更有可能存在协同进化关系。我们的研究结果提示,鱼类的CD4-2发挥了高等动物CD4的类似功能,而更有可能作为Th或Treg细胞的表面标记分子,接收外来刺激信号。CD4+CD25+foxp3+Treg细胞是一类重要的T细胞亚群,它能够诱导和维持外周免疫耐受,其功能受损与许多疾病密切相关。我们首次在低等脊椎动物中鉴定到这类细胞的存在,并从标记分子克隆、细胞表型分析、及抑制免疫活性等方面进行了分析。体外实验证明,这类细胞的缺失会引起混合淋巴细胞反应（MLR）及非特异性细胞毒效应（NCC）的显著增强;而体内移除这类细胞则会导致肠道炎症的发生。本文的研究填补了鱼类免疫学的空白,有助于更好地认识低等脊椎动物CD4分子、调节性T细胞及它们介导的细胞调控网络,进而更全面地理解脊椎动物免疫系统的进化规律。鉴于Treg细胞在获得性免疫系统中的重要作用,鱼类Treg细胞的鉴定,不仅将为水产病害的防治提供新的策略;也为相关的临床治疗研究及药物开发提供了潜在的新模型。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 1 绪论:调节性T细胞研究进展
• 1.1 调节性T细胞的研究历史
• 1.2 调节性T细胞的分类
• +CD25⁺Treg细胞'>1.2.1 自然发生CD4⁺CD25⁺Treg细胞
• 1.2.1.1 自然发生CD4+CD25+Treg细胞的发育
• +CD25⁺Treg细胞的表型'>1.2.1.2 自然发生CD4⁺CD25⁺Treg细胞的表型
• +CD25⁺Treg细胞的抑制作用'>1.2.1.3 自然发生CD4⁺CD25⁺Treg细胞的抑制作用
• 1.2.2 诱导型调节性T细胞
• 1.2.2.1 Tr1细胞
• 1.2.2.2 Th3细胞
• 1.2.3 其它调节性T细胞
• 1.2.3.1 NKT细胞
• 1.2.3.2 γδT细胞
• +T细胞'>1.2.3.3 CD8⁺T细胞
• 1.3 调节性T细胞的抑制机制
• 1.4 调节性T细胞与人类疾病研究
• 1.4.1 Treg细胞与自身免疫疾病
• 1.4.1.1 系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）
• 1.4.1.2 Ⅰ型糖尿病（insulin-dependent diabetes mellitus,IDDM）
• 1.4.1.3 炎症性肠炎（inflammatory bowel disease,IBD）
• 1.4.1.4 类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）
• 1.4.1.5 其它自身免疫疾病
• 1.4.2 Treg细胞与肿瘤免疫
• 1.4.2.1 Treg细胞诱导肿瘤耐受机制
• 1.4.2.2 Treg细胞与肿瘤治疗
• 1.4.3 Treg细胞与移植耐受
• 1.4.4 Treg细胞与病原感染
• 1.5 调节性T细胞小结
• 2 实验研究:鱼类CD4分子研究
• 2.1 鱼类CD4分子克隆及鉴定
• 2.1.1 材料与方法
• 2.1.1.1 实验鱼
• 2.1.1.2 菌株与试剂
• 2.1.1.3 数据库及软件
• 2.1.1.4 生物信息学预测及分析
• 2.1.1.5 总RNA提取及cDNA合成
• 2.1.1.6 河豚鱼及斑马鱼CD4基因分子克隆
• 2.1.1.7 T-A克隆
• 2.1.1.8 测序鉴定
• 2.1.2 结果与讨论
• 2.1.2.1 河豚CD4基因克隆
• 2.1.2.2 斑马鱼CD4基因克隆
• 2.1.2.3 河豚及斑马鱼CD4基因结构分析
• 2.1.2.4 鱼类CD4序列比对及进化分析
• 2.2 河豚鱼CD4分子重组蛋白表达及多克隆抗体制备
• 2.2.1 材料与方法
• 2.2.1.1 实验动物
• 2.2.1.2 菌株与试剂
• 2.2.1.3 河豚CD4-2及CD4-4重组质粒构建
• 2.2.1.4 融合蛋白表达
• 2.2.1.5 融合蛋白包涵体纯化
• 2.2.1.6 河豚抗CD4-2及CD4-4多抗制备
• 2.2.1.7 间接ELISA法测定抗血清效价
• 2.2.1.8 多克隆抗体的特异性检测
• 2.2.2 结果与讨论
• 2.2.2.1 重组质粒构建
• 2.2.2.2 河豚CD4分子胞外区序列重组表达
• 2.2.2.3 河豚CD4-2及CD4-4多抗制备
• 2.3 河豚鱼CD4配体分子
• 2.3.1 材料与方法
• 2.3.1.1 实验动物
• 2.3.1.2 河豚IL-16及MHC-Ⅱ分子克隆及鉴定
• 2.3.1.3 河豚IL-16重组蛋白
• 2.3.1.4 河豚淋巴细胞分离
• 2.3.1.5 IL-16趋化试验
• 2.3.2 结果与讨论
• 2.3.2.1 河豚IL-16基因
• 2.3.2.2 河豚IL-16序列分析
• 2.3.2.3 河豚MHC-Ⅱ β2结构域克隆
• 2.3.2.4 河豚IL-16重组蛋白表达及纯化
• 2.3.2.5 IL-16趋化作用
• 2.4 鱼类CD4分子功能分工
• 2.4.1 材料与方法
• 2.4.1.1 抗体与试剂
• 2.4.1.2 免疫细胞化学
• 2.4.1.3 流式细胞术
• 2.4.1.4 磁珠分选河豚CD4阳性细胞
• 2.4.1.5 河豚CD4阳性细胞分析
• 2.4.1.6 共进化分析
• 2.4.1.7 淋巴细胞体内增殖试验
• 2.4.1.8 抗体封闭试验
• 2.4.2 结果与讨论
• 2.4.2.1 河豚CD4阳性淋巴细胞群体分析
• 2.4.2.2 CD4及其配体共进化分析
• +CD4-4⁺细胞增殖试验'>2.4.2.3 CD4-2⁺CD4-4⁺细胞增殖试验
• +细胞'>2.4.2.4 鱼类IL-16趋化CD4-2⁺细胞
• 2.5 鱼类CD4分子小结
• 3 实验研究:鱼类Treg细胞亚群鉴定
• 3.1 鱼类Treg细胞标志分子foxp3鉴定
• 3.1.1 材料与方法
• 3.1.1.1 实验动物
• 3.1.1.2 河豚foxp3分子克隆及鉴定
• 3.1.1.3 河豚foxp3组织分布
• 3.1.1.4 河豚foxp3原位杂交（in situ hybridization,ISH）
• 3.1.2 结果与讨论
• 3.1.2.1 河豚foxp3基因
• 3.1.2.2 河豚foxp3分布
• 3.2 鱼类Treg细胞表型鉴定
• 3.2.1 材料与方法
• 3.2.1.1 抗体与试剂
• 3.2.1.2 抗体交叉反应检测
• 3.2.1.2 免疫细胞化学
• 3.2.1.3 流式细胞术
• 3.2.1.4 鱼类Treg细胞分析
• 3.2.2 结果与讨论
• 3.2.2.1 抗体特异性检测
• +CD25⁺foxp3⁺淋巴细胞'>3.2.2.2 河豚中CD4⁺CD25⁺foxp3⁺淋巴细胞
• 3.3 鱼类Treg细胞功能鉴定
• 3.3.1 材料与方法
• 3.3.1.1 抗体与试剂
• 3.3.1.2 体外及体内移除Treg细胞
• 3.3.1.3 混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction,MLR）
• 3.3.1.4 非特异性细胞毒细胞（nonspecific cytotoxic cell,NCC）杀伤效应
• 3.3.1.5 鱼类炎症性肠炎模型
• 3.3.2 结果与讨论
• +CD25⁺细胞的体外免疫抑制作用'>3.3.2.1 鱼类CD4⁺CD25⁺细胞的体外免疫抑制作用
• +CD25⁺细胞引发鱼类肠炎'>3.3.2.2 体内移除CD4⁺CD25⁺细胞引发鱼类肠炎
• 3.4 鱼类Treg细胞小结
• 4 参考文献
• 作者简历