I型鸭肝炎病毒VP1蛋白的表达纯化及单克隆抗体的制备

论文摘要

鸭病毒性肝炎（DVH）是由鸭肝炎病毒（DHV）引起的一种主要发生于4周龄以下雏鸭的传播迅速、高度致死性的传染病。在我国爆发的鸭肝炎主要是由DHV-I引起,雏鸭一旦感染DHV死亡率为100%。本实验对DHV-I的EF14株VP1基因进行了RT-PCR扩增。建立了重组表达质粒,命名为pET30a-VP1。并制备了纯度较高的DHV-I抗原,以此免疫Balb/c小鼠并建立了间接ELISA筛选方法。经过一系列的融合筛选,成功研制了抗Ⅰ型DHV单克隆抗体3株。本实验为实验室建立DHV快速诊断方法及今后对DHV-I的研究奠定了基础。根据GenBank发表的DHV-I全基因组序列设计合成一对引物（含有BamH I和Xho I两个酶切位点）,利用PCR技术扩增VP1基因,并克隆入pMD18-T载体,测序鉴定。将阳性VP1基因插入表达载体pET30a中,构建重组表达质粒pET30a-VP1,进行PCR和双酶切鉴定,并使其在大肠杆菌BL21中高效表达。融合蛋白为包涵体形式存在,经超声破碎后,利用SDS-PAGE电泳观察外源基因表达条带大小是否与预期相符。并对融合蛋白进行纯化。用纯化的蛋白作为抗原来免疫Balb/c小鼠后建立间接ELISA筛选方法。细胞融合前反复试验,确定了间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株的最佳反应条件,阳性血清和阴性血清分别作为阳性和阴性对照。取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用间接ELISA方法筛选出3株阳性杂交瘤细胞株,将获得的阳性细胞株用有限稀释法进行3次亚克隆,分别命名为2D9、2D10和5F7。最后将扩大培养的杂交瘤细胞注入Balb/c小鼠腹腔,每只注射2×106个细胞使其产生腹水,制备单克隆抗体。对这3株单克隆抗体的稳定性、抗体亚类、腹水效价、特异性进行了鉴定,结果表明本实验所获得的单抗均具有良好的特异性。本研究成功制备了3株能稳定分泌抗DHV-I VP1蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞株,试验表明已经掌握了体外细胞分离培养、抗原鉴定纯化以及细胞融合技术,这为制备更多的单抗、研制抗原检测试剂盒以及对I型鸭肝炎病毒的进一步研究奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 DHV 的流行及分布
• 1.2 DHV 的分类地位
• 1.3 病原学特性
• 1.4 致病特征
• 1.5 分子生物学特性
• 1.5.1 小RNA 病毒的基因组结构及其功能
• 1.5.2 DHV-I 的基因组结构及其功能
• 1.5.3 DHV-I 的蛋白结构及其功能
• 1.6 诊断方法
• 1.6.1 病原分离技术
• 1.6.2 中和试验
• 1.6.3 琼脂扩散试验
• 1.6.4 凝集试验
• 1.6.5 荧光抗体试验
• 1.6.6 胶体金技术
• 1.6.7 酶联免疫吸附试验
• 1.6.8 分子生物学诊断技术
• 1.7 单克隆抗体技术
• 1.8 本实验目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 毒株与载体
• 2.1.2 实验胚、动物与细胞
• 2.1.3 工具酶及生化试剂
• 2.1.4 主要试剂的配置
• 2.1.5 仪器设备
• 2.1.6 引物的合成
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 目的基因的克隆
• 2.2.1.1 病毒RNA 提取
• 2.2.1.2 病毒cDNA 获得
• 2.2.1.3 目的基因RT-PCR 扩增
• 2.2.1.4 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定及VP1 基因片段的回收
• 2.2.2 VP1 基因的鉴定
• 2.2.2.1 VP1 基因与T 载体的链接
• 2.2.2.2 连接产物的转化
• 2.2.2.3 阳性转化子筛选与鉴定
• 2.2.3 重组表达载体的构建
• 2.2.3.1 pET-30a 表达载体的制备
• 2.2.3.2 带有粘性末端目的基因的制备
• 2.2.3.3 连接与转化
• 2.2.3.4 重组质粒的筛选与鉴定
• 2.2.3.5 重组阳性质粒转化表达菌株
• 2.2.4 融合蛋白表达
• 2.2.4.1 构建pET30a-VP1 质粒的表达条件
• 2.2.4.2 融合蛋白SDS-PAGE 分析
• 2.2.4.3 融合蛋白Western-blot 检测
• 2.2.5 免疫原的制备
• 2.2.5.1 融合蛋白的纯化
• 2.2.5.2 纯化蛋白的SDS-PAGE 分析及Western-blot 检测
• 2.2.6 间接ELISA 检测方法的初步建立
• 2.2.6.1 抗原蛋白、一抗及酶标抗体工作浓度的确定
• 2.2.6.2 检测方法的准确率测试
• 2.2.7 单克隆抗体的制备
• 2.2.7.1 小鼠免疫
• 2.2.7.2 免疫小鼠血清效价的测定
• 2.2.7.3 饲养层细胞的制备
• 2.2.7.4 骨髓瘤细胞的制备
• 2.2.7.5 脾细胞的制备
• 2.2.7.6 细胞融合
• 2.2.7.7 杂交瘤细胞的筛选
• 2.2.7.8 阳性杂交瘤细胞的克隆
• 2.2.8 阳性杂交瘤细胞的冻存与复苏
• 2.2.8.1 杂交瘤细胞的冻存
• 2.2.8.2 杂交瘤细胞的复苏
• 2.2.9 杂交瘤细胞的鉴定
• 2.2.9.1 杂交瘤细胞稳定性试验
• 2.2.9.2 杂交瘤细胞上清western-blot 鉴定
• 2.2.10 单克隆抗体的鉴定
• 2.2.10.1 单抗腹水的制备
• 2.2.10.2 单克隆抗体亚型鉴定
• 2.2.10.3 单克隆抗体腹水效价测定
• 2.2.10.4 单克隆抗体Dot-ELISA 检测
• 2.2.10.5 单克隆抗体特异性鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 目的基因RT-PCR 鉴定结果
• 3.2 重组表达质粒的鉴定
• 3.3 融合蛋白表达与纯化蛋白鉴定
• 3.4 间接ELISA 检测方法优化
• 3.5 杂交瘤细胞的筛选结果
• 3.5.1 免疫小鼠血清效价测定
• 3.5.2 阳性杂交瘤细胞株的筛选及克隆化
• 3.6 阳性杂交瘤细胞的鉴定结果
• 3.6.1 稳定性鉴定结果
• 3.6.2 Western-blot 鉴定结果
• 3.7 单克隆抗体的鉴定结果
• 3.7.1 单抗亚型测定
• 3.7.2 单抗腹水效价测定
• 3.7.3 Dot-ELISA 检测结果
• 3.7.4 免疫荧光检测结果
• 4 讨论
• 4.1 表达条件的优化
• 4.2 单克隆抗体制备
• 4.3 ELISA 检测方法的优化
• 4.4 单抗特异性检测
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文