脐带基质干细胞的分离、鉴定及其向生殖细胞分化的初步研究

论文摘要

目的:1.建立分离培养人脐带基质干细胞（umbilical cord matrix stem cells , UC- MSCs）的方法,了解其生物学特性及分化潜能。2.探讨UC-MSCs在体外向生殖细胞分化的潜能。3.观察UC-MSCs移植后在小鼠早衰卵巢中的定位及生长。方法:1.无菌条件下取正常足月顺产新生儿的脐带,用Ⅰ型胶原酶消化,分离单个核细胞,DMEM培养,获得贴壁细胞,监测细胞生长曲线、流式细胞仪检测其免疫表型。采用不同条件培养基诱导细胞向成脂、成骨、成软骨方向分化。2.通过RT-PCR检测UC-MSCs中生殖系特异性标记物的表达,采用卵泡液作为条件培养基,体外诱导UC-MSCs向生殖细胞分化。3.通过化疗药物处理建立卵巢早衰（Premature ovarian failure , POF）动物模型,腺病毒介导Ad-GFP转染UC-MSCs,经尾静脉移植于POF小鼠体内,在不同时间点取材进行冰冻切片,通过激光共聚焦检查移植细胞在卵巢中的定位和生长情况。结果: 1.分离的脐带单核细胞培养后呈纺锤体样,其倍增时间为31.11±2.45 h,体外增殖达10代以上,P3代细胞中约85.84%处于G0/ G1期, 14.16%的细胞处于S + G2 + M期。其分子免疫表型为:CD29、CD44、CD73（SH3）、CD90、CD105 （SH2）阳性;SSEA-4弱阳性;CD31、CD34、CD45、HLA-DR阴性,与BM-MSCs的免疫表型相似。在不同的诱导条件下,UC-MSCs可形成脂滴、骨结节、软骨结节等结构,并表达脂肪、骨及软骨细胞相关的特异性基因。2. UC-MSCs表达OCT4、Stella、Ifitm3等生殖系标记物,在含5%、10%、20%等不同浓度卵泡液的诱导条件下细胞可聚集分化形成卵母细胞样结构。3.采用环磷酰胺（cyclophosphamide , CTX）和白消安（busulfan , BUS）处理可成功建立小鼠卵巢早衰模型;腺病毒介导Ad-GFP转染UC-MSCs的效率达95%左右;UC-MSCs经尾静脉移植后,在受损小鼠卵巢中可发现大量GFP阳性细胞存活生长,但在大脑、肝脏、肾脏、胰腺等组织中未发现GFP阳性细胞存在。结论:1.人UC-MSCs可在体外培养、扩增,细胞免疫表型与BM-MSCs相似,具有成脂、成骨、成软骨等多向分化潜能,是一种理想的成体干细胞来源。2.UC-MSCs表达生殖系特异性标记物,体外诱导可形成卵母细胞样结构,初步表明UC-MSCs具有分化为生殖细胞的潜能。3.UC-MSCs移植后能够迁移至功能早衰卵巢并存活生长,提示UC-MSCs可能具有卵巢损伤修复的作用。

论文目录

• 英文缩写一览表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 正文 脐带基质干细胞的分离、鉴定及其向生殖细胞分化的初步研究
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 脐带基质干细胞的分离及其生物学特性研究
• 实验一 脐带基质干细胞的分离与鉴定
• 摘要
• 一 材料
• 二 方法
• 三 结果
• 四 讨论
• 参考文献
• 实验二 脐带基质干细胞生殖系相关基因的检测
• 摘要
• 一 材料
• 二 方法RT-PCR
• 三 结果
• 四 讨论
• 参考文献
• 第二部分 脐带基质干细胞向生殖细胞分化的初步研究
• 实验一 体外诱导脐带基质干细胞向女性生殖细胞分化
• 摘要
• 一 材料
• 二 方法
• 三 结果
• 四 讨论
• 参考文献
• 实验二 脐带基质干细胞移植后在早衰卵巢中的定位与生长
• 摘要
• 一 材料
• 二 方法
• 三 结果
• 四 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢
• 照片
• 文献综述一 干细胞向生殖细胞分化的相关研究
• 参考文献
• 文献综述二 未成熟卵体外培养技术的临床应用
• 参考文献
• 硕士在读期间发表的论文