论文摘要
HSP70L1（HSP70-like protein 1）是2004年曹等人从人树突状细胞（dendritic cells）cDNA文库分离获得的一个HSP70家族新成员。该蛋白含有509个氨基酸残基,理论分子量54.8kDa,不含跨膜区和信号肽,与鼠HSP70的同源性达90.5%,而与人HSP70家族的其它分子的同源性仅33.7%到35.7%。HSP70L1能与DC细胞表面受体CD91、TLR2、TLR4相互作用,促进DC细胞成熟并分泌炎症因子。HSP70L1作为多肽免疫佐剂,与表位多肽交联或者融合表达后,促进DC细胞成熟并分泌细胞因子,激发多肽特异性的Th1反应和CTL（cytotoxic T lymphocyte）反应,抑制肿瘤细胞生长或抵抗病毒的攻击。HSP70L1与MPP11形成稳定的复合物,组成哺乳动物细胞的核糖体相关复合物（ribosome-associated complex,RAC）,结合新生肽促进其正确折叠、从核糖体肽合成通道转运出来、避免肽链后退影响肽链的延伸,同时可以清除聚集在核糖体中的蛋白。作为一个新发现的蛋白,HSP70L1除作为免疫佐剂和核糖体相关复合物组成蛋白之外,其他生物功能尚不清楚。本研究首先在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白His-HSP70L1和GST-HSP70L1,用GST-HSP70L1免疫新西兰大耳白兔获得抗血清,用His-HSP70L1亲和纯化抗血清,获得能够识别HSP70L1的兔多克隆抗体。用HSP70L1的兔多克隆抗体检测其在不同细胞中的蛋白表达水平,结果发现在蛋白水平上HSP70L1在K562细胞中的表达量最高,且提示其能够形成二聚体,通过免疫共沉淀实验证实该蛋白在细胞内确实能够形成二聚体。选择HSP70L1基因的766-784位碱基为靶点,构建RNAi的载体,转染K562细胞、Hela细胞后用G418进行压力筛选,建立HSP70L1 RNAi稳定细胞系。然后用MTT法比较野生株与RNAi稳定细胞株的增殖,发现RNAi稳定细胞株比野生株显著性的减慢,提示HSP70L1在细胞内支持细胞增殖。为了观察HSP70L1是不是通过影响细胞周期来影响细胞增殖,我们使用mimosine将细胞同步化在G1期后,观察细胞的周期进程,发现RNAi稳定细胞株的G1/S,G2/M转化明显落后于野生株细胞。CDC2被蛋白激酶Wee1和Myt1磷酸化14位苏氨酸和15位酪氨酸而处于非活化状态,磷脂酶CDC25C通过对CDC2的15位酪氨酸的去磷酸化作用激活CDC2-CyclinB复合物,促进细胞有丝分裂。与野生株相比,HSP70L1/RNAi稳定细胞系中CDC2表达水平没有明显变化,但是作为非活性形式的p-CDC2在RNAi稳定细胞株中明显的累积。在293过表达HSP70L1和CDC2/CDC25C,免疫沉淀实验发现HSP70L1与CDC25C相互作用,而不与CDC2相互作用。上述研究结果表明,HSP70L1通过与CDC25C相互作用,调节CDC2的活性,促进细胞周期进程,从而影响细胞增殖。当细胞发生DNA损伤时,细胞启动“DNA损伤检查点调控”机制使细胞发生G2/M期阻滞,这个过程受到CDC2活性的调节。用DNA损伤试剂CDDP刺激细胞,发现在Hela/HSP70L1 RNAi稳定细胞株出现明显G2/M期阻滞,提示HSP70L1参与细胞周期的检查点调控。用Transwell研究肿瘤细胞的体外侵袭能力,发现的Hela/HSP70L1 RNAi稳定细胞株侵袭能力较比野生株显著增强,说明HSP70L1抑制细胞的侵袭能力。用多西紫杉醇刺激细胞,发现HSP70L1敲低的K562细胞凋亡敏感性显著降低;而在Hela细胞中,HSP70L1敲低后细胞凋亡敏感性显著提高。进一步,用CDDP处理Hela细胞,发现HSP70L1敲低后细胞对DNA损伤诱导的细胞凋亡同样显著性增加,这些结果提示HSP70L1参与细胞的凋亡过程,该功能可能受非受体酪氨酸激酶c-Abl调控。c-abl （cellular-Abelson gene）是Abelson鼠白血病病毒（murine leukemia virus） v-abl原癌基因在细胞内的同源基因,广泛表达于哺乳动物各组织中。c-Abl的C端有三个核定位信号,一个核输出信号,故c-Abl可以在细胞核和细胞质间穿梭,c-Abl的核定位影响细胞的功能。向细胞中导入针对c-Abl的反义RNA或敲除细胞中的c-Abl会显著提前细胞进入S期的时间;在过量表达的情况下,c-Abl会导致成纤维细胞滞留在G1期,并引起细胞凋亡,延迟细胞进入S期。c-Abl通过激活WAVE2/WAVE3与Arp2/3结合,促进F-actin成核延伸,细胞骨架发生变化。DNA损伤激活的c-Abl可以通过SH3与p73的同源寡聚区结合,磷酸化p73的99位酪氨酸,刺激p73介导的转录活性和凋亡作用。总之c-Abl在正常生理条件及病理条件下具有多种生物功能:参与细胞增殖、细胞黏附、细胞凋亡、应激反应、炎症反应、细胞转化等过程的调控。利用酵母双杂交系统,以全长的c-Abl作为诱饵蛋白,对Hela细胞cDNA文库进行筛选,获得了一系列与Abl激酶家族蛋白相互作用的靶分子,其中就有HSP70L1,通过研究二者的相互作用及其在细胞中的生物效应,将为HSP70L1的生物功能及其分子机制的阐明提供线索。本研究利用免疫沉淀、免疫印迹、GST-Pull down以及Far Western等方法证明了HSP70L1通过C端的120氨基酸片段与c-Abl在细胞内存在直接的相互作用。通过构建不同的截断体,发现HSP70L1可通过429到469之间的氨基酸序列与c-Abl发生相互作用,然后利用点突变的方法发现了HSP70L1通过第433位脯氨酸与c-Abl的结合。用以c-Abl基因的1346-1364位碱基为靶点构建的c-Abl/Arg RNAi的载体,转染Hela/HSP70L1 RNAi稳定细胞株后用潮霉素B进行压力筛选,建立Hela/HSP70L1 RNAi/c-Abl RNAi稳定细胞系。用CDDP诱导细胞凋亡,结果发现,当HSP70L1被siRNA敲低后,细胞在CDDP的诱导下凋亡率显著升高,而同时敲低HSP70L1和c-Abl后,凋亡率明显下降,说明Hela/HSP70L1 RNAi稳定细胞株的凋亡易感性与c-Abl相关。c-Abl能与PSMA、FHL2相互作用,利用免疫沉淀发现HSP70L1亦能与PSMA、FHL2相互作用,这些结果为了解HSP70L1的功能提供线索。本课题通过RNAi技术,发现HSP70家族的新成员HSP70L1参与细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的调控,且其活性受非受体酪氨酸激酶c-Abl的调控。
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相关论文文献
- [1].HSP70L1介导的细胞内致敏DC疫苗高效诱导抗肿瘤CTL[J]. 中国肿瘤生物治疗杂志 2017(03)
- [2].Hsp70L1增强肿瘤细胞疫苗免疫原性的研究[J]. 细胞与分子免疫学杂志 2010(04)