轮枝镰孢及菌寄生真菌纤细齿梗孢蛋白激酶基因的克隆与功能分析

论文摘要

轮枝镰孢菌（Fusarium verticillioide）是一种重要的植物病原真菌,可引起玉米苗枯病、穗腐病等,纤细齿梗孢（Olpitrichum tenellum）是轮枝镰孢菌上的一种菌寄生真菌,为了研究纤细齿梗孢-轮枝镰孢菌-玉米之间的识别、互作、寄生和侵染致病机制,笔者以与信号传导有关的蛋白激酶基因为切入点并结合随机插入突变对此进行了探讨。摸索掌握了两种真菌原生质体制备技术;建立并优化了轮枝镰孢菌的REMI和ATMT遗传转化体系,获得了数十个突变体;克隆得到两种真菌的4个丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶基因;并通过同源重组成功敲除了轮枝镰孢菌的2个蛋白激酶基因,明确了它们的生物学功能。1.掌握了两种真菌的原生质体制备技术,摸索了影响两种真菌原生质体制备的条件,包括菌龄、酶的种类和浓度、酶解时间和温度以及稳渗剂等,找到了两种真菌原生质体制备的最佳条件,其中轮枝镰孢菌采用PDB培养14h的菌丝,以0.7mol/LNaCl为稳渗剂,在30℃、100rpm下用20mg/mL溶壁酶酶解4h,原生质体制备量最大;而纤细齿梗孢采用PDB培养3648h的菌丝,在30℃、100rpm下用30mg/mL溶壁酶酶解5h原生质体制备量最大。2.以含有潮霉素磷酸转移酶基因的质粒pUC ATPH转化轮枝镰孢菌FT1菌株和纤细齿梗孢OL1菌株的原生质体,前者取得了成功,共获得转化子300多个,转接5代能稳定遗传,PCR验证潮霉素基因已插入转化子基因组DNA中,通过表型观察和致病性测定,发现许多生长异常突变体,2株致病性减弱突变体;而纤细齿梗孢没有得到转化子。3.在植物转化载体pROKII基础上导入带有真菌启动子的潮霉素B抗性基因表达盒PtrpC-hph-TtrpC,构建了一个适合真菌转化的载体pROKII-PtrpC-hph-TtrpC,冻溶法转入农杆菌LBA4404。利用这一转化载体,成功地建立起了轮枝镰孢菌的ATMT遗传转化体系,获得了T-DNA插入突变体;而转化纤细齿梗孢却没有取得成功。摸索优化了转化条件,在镰孢菌孢子浓度106个/mL、农杆菌OD600=0.150.20、乙酰丁香酮浓度为200μmol/mL的条件下共培养36h转化效率最高,可达60120个/106个孢子。共获得转化子1000多个,连续转接5代能够稳定遗传,PCR验证潮霉素B抗性基因已整合进转化子基因组DNA中,部分转化子表现为生长和形态异常。4.利用兼并PCR,TAIL PCR和RACE技术相结合克隆得到两种真菌的四个丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶基因,分别命名为fpk1、fmk1、opk1和omk1 （GenBank登录号分别为:EF405958、EU417814、EU417815和EU479712）。其中fpk1由ATG到TAA的DNA全长1854bp,包含3个内含子,长度分别为66bp、54bp、54bp;cDNA全长1680bp,编码559个氨基酸的多肽,序列比对和分析显示其属于cAMP依赖的蛋白激酶PKA。opk1基因自ATG到TAA的DNA全长2223bp,包含2个内含子,分别长108bp、84bp,cDNA全长2031bp,编码676个氨基酸的多肽,序列比对和cAMP依赖的蛋白激酶同源性较低,可能属于另外一种Ser/Thr蛋白激酶。fmk1和omk1属于Fus3/Kss1类MAPK基因,cDNA全长均为1068bp,编码355个氨基酸的多肽,前者DNA全长1242bp,包含3个内含子,长度分别为58bp、56bp和60bp;后者DNA全长1198bp,包含2个内含子,长度分别为57bp和73bp,内含子边界均符合GT-AG规则。5.依据同源重组原理,以pUCATPH和pBS为基础构建了基因fpk1和fmk1的敲除突变载体pBS-K-hph和pUCATPH-KS-KX,以REMI介导的转化手段转化轮枝镰孢菌原生质体,成功筛选到了fpk1和fmk1基因敲除突变体。通过对突变体的表型特征进行研究分析,明确了两基因的生物学功能,证实两基因与菌丝生长、胞壁分化、孢子产生和萌发以及致病性等密切相关。

论文目录

• 英文缩略词及中文对照
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 前言
• 第一节 丝状真菌的遗传转化研究进展
• 1 丝状真菌的转化方法
• 1.1 原生质体-PEG 转化
• 1.2 脂质体转化法
• 1.3 电击转化法
• 1.4 醋酸锂转化法
• 1.5 限制酶介导的转化（restriction enzyme-mediated integration,REMI）
• 1.5.1 REMI 的机理
• 1.5.2 REMI 转化的一般步骤
• 1.5.3 REMI 插入突变的主要优点
• 1.5.4 REMI 在植物病原真菌上的应用
• 1.5.5 REMI 技术的其他用途
• 1.5.6 REMI 技术的展望
• 1.6 农杆菌介导的转化
• 1.6.1 根癌农杆菌
• 1.6.2 农杆菌的生物学特性
• 1.6.3 农杆菌的分类
• 1.6.4 农杆菌Ti 质粒的结构
• 1.6.5 根癌农杆菌介导真菌遗传转化的机理
• 1.6.6 根癌农杆菌介导转化的真菌种类
• 1.6.7 根癌农杆菌介导丝状真菌转化的特点
• 1.6.8 根癌农杆菌介导真菌遗传转化的应用
• 1.6.9 农杆菌介导真菌遗传转化技术展望
• 2 关于轮枝镰孢菌和纤细齿梗孢的遗传转化
• 第二节 蛋白激酶及其信号通路研究进展
• 1 蛋白激酶概述
• 1.1 蛋白激酶在细胞信号转导中的作用和意义
• 1.2 蛋白激酶的分类研究
• 1.3 蛋白激酶的共同特征
• 1.3.1 蛋白激酶一级结构的特征
• 1.3.2 蛋白激酶的生化特征
• 1.4 蛋白激酶的调控机制
• 1.4.1 蛋白激酶对靶底物的调控方式
• 1.4.2 蛋白激酶活性的激活和抑制
• 2 真菌及植物病原真菌蛋白激酶的研究现状
• 2.1 蛋白激酶在真菌信号传导中的作用
• 2.2 丝状真菌蛋白激酶的种类及研究现状
• 2.2.1 cAMP 依赖性蛋白激酶PKA
• 2.2.2 蛋白激酶C
• 2.2.3 促分裂蛋白激酶 MAPK
• 2.2.4 其他的Ser/Thr 激酶
• 第三节 本研究的立题依据、研究内容和技术路线
• 1 立题依据
• 2 研究内容
• 3 技术路线
• 第二章 轮枝镰孢菌和纤细齿梗孢遗传转化体系建立及随机插入突变体的筛选
• 第一节 限制性内切酶介导的轮枝镰孢菌和纤细齿梗孢的遗传转化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料和试剂
• 1.1.1 供试菌株和质粒
• 1.1.2 试剂和药品
• 1.1.3 仪器和设备
• 1.1.4 培养基及配制
• 1.1.5 溶液配制
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 原生质体的制备与再生
• 1.2.1.1 菌龄对原生质体制备的影响
• 1.2.1.2 酶浓度对原生质体制备的影响
• 1.2.1.3 酶解时间对原生质体制备的影响
• 1.2.1.4 酶解温度对原生质体制备的影响
• 1.2.1.5 稳渗剂对原生质体制备的影响
• 1.2.2 原生质体的纯化
• 1.2.3 质粒pUCATPH 的扩增、提取
• 1.2.4 质粒pUCATPH 的线性化
• 1.2.5 DNA 琼脂糖凝胶电泳
• 1.2.6 潮霉素B 对轮枝孢镰孢菌和纤细齿梗孢菌丝生长和孢子萌发抑制浓度的筛选
• 1.2.7 REMI 转化
• 1.2.8 转化子的PCR 检测
• 1.2.8.1 被转化菌总DNA 的提取
• 1.2.8.2 PCR 检测
• 1.2.9 转化子的稳定性测定
• 1.2.10 突变体的表型鉴定
• 1.2.11 突变体致病性测定
• 2 结果与分析
• 2.1 原生质体制备
• 2.1.1 不同条件对原生质体制备的影响
• 2.1.1.1 菌龄对原生质体制备的影响
• 2.1.1.2 溶壁酶浓度对原生质体制备的影响
• 2.1.1.3 酶解时间对原生质体制备的影响
• 2.1.1.4 酶解温度对原生质体制备的影
• 2.1.1.5 稳渗剂对原生质体制备的影响
• 2.1.2 原生质体的再生
• 2.1.3 原生质体形成与再生过程的显微镜观察
• 2.2 线性质粒pUCATPH 的制备
• 2.3 轮枝镰孢的潮霉素最佳抑制浓度的筛选
• 2.4 REMI 转化
• 2.5 转化子的PCR 验证
• 2.6 表型突变体的鉴定
• 2.7 致病性突变体
• 3 结论与讨论
• 3.1 原生质体的制备与再生
• 3.1.1 影响原生质体制备的因素
• 3.1.2 影响原生质体再生的因素
• 3.2 REMI 转化
• 3.2.1 REMI 的插入位点
• 3.2.2 REMI 中的限制性内切酶
• 3.2.3 REMI 中的质粒
• 3.2.4 REMI 的局限性
• 第二节 根癌农杆菌介导的轮枝镰孢菌遗传转化及T-DNA插入突变体的获得
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试菌和转化质粒
• 1.1.2 抗生素和试剂
• 1.1.3 培养基
• 1.2 载体的构建
• 1.3 重组质粒转化农杆菌LBA4404 受体细胞
• 1.4 抑制农杆菌生长的抗生素最佳浓度筛选
• 1.5 农杆菌介导的遗传转化操作方法
• 1.6 转化条件变化对转化效率的影响
• 1.6.1 AS 浓度的影响
• 1.6.2 共培养时间的影响
• 1.6.3 受体菌孢子浓度的影响
• 1.6.4 农杆菌浓度的影响
• 1.7 转化子的PCR 分析
• 1.8 转化子的稳定性测定
• 1.9 表型突变体的鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 载体pROK2-PtrpC-hph-TtrpC 的构建
• 2.1.1 在pROK2 基础上构建pROK2-PtrpC-hph-TtrpC 二元载体
• 2.1.2 质粒pUCATPH 和pROK2 的酶切产物
• 2.1.3 含潮霉素B 抗性基因的DNA 片段PtrpC-hph-TtrpC 的插入识别
• 2.2 农杆菌对头孢霉素敏感性的测定结果
• 2.3 轮枝镰孢菌的ATMT 转化
• 2.3.1 转化结果
• 2.3.2 转化条件对转化效率的影响
• 2.4 转化子的PCR 验证
• 2.5 稳定性检验
• 2.6 表型观察
• 3 结论与讨论
• 3.1 农杆菌菌株的选择
• 3.2 共培养时间
• 3.3 共培养温度
• 3.4 AS 的浓度
• 3.5 农杆菌和受体菌的比例
• 第三节 本章小结
• 1 结果及原因分析
• 1.1 结果
• 1.2 原因分析
• 2 下一步工作建议与展望
• 2.1 关于纤细齿梗孢的转化
• 2.2 关于轮枝镰孢菌的转化
• 第三章 两种真菌丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶基因的克隆
• 第一节 轮枝镰孢 cAMP 依赖的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶基因 fpk1 的克隆
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试菌株与质粒
• 1.1.2 酶和生化试剂
• 1.1.3 主要仪器和设备
• 1.1.4 培养基
• 1.1.5 试剂与溶液的配置
• 1.2 目的基因的克隆
• 1.2.1 引物设计
• 1.2.2 总RNA 的提取（Trizol 法）
• 1.2.3 紫外检测RNA 产率和纯度
• 1.2.4 反转录cDNA 第一链的合成
• 1.2.5 目的基因cDNA 中间片段的分离
• 1.2.5.1 基因cDNA 中间片段的扩增
• 1.2.5.2 PCR 产物回收
• 1.2.5.3 载体连接
• 1.2.5.4 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备和转化
• 1.2.5.4.1 DH5α感受态制备
• 1.2.5.4.2 大肠杆菌感受态的转化
• 1.2.5.5 重组质粒的筛选与鉴定
• 1.2.5.5.1 IPTG-X-gal 筛选
• 1.2.5.5.2 菌落PCR 检测
• 1.2.5.5.3 碱法小量提取质粒DNA
• 1.2.5.5.4 质粒DNA 的酶切鉴定
• 1.2.5.5.5 序列测定
• 1.2.6 目的基因3’末端的分离（3’-RACE）
• 1.2.7 目的基因5’末端的分离（5’-RACE）
• 1.2.8 蛋白激酶基因 fpk1 的全长 DNA 序列的克隆
• 1.2.9 全长序列的生物信息学分析
• 2 结果与分析
• 2.1 总 RNA 的提取
• 2.2 中间片段的获得
• 2.3 fpk1 基因的 3’端序列的获得
• 2.4 fpk1 基因 5’端序列的获得
• 2.5 fpk1 基因全长 DNA 序列的克隆
• 2.6 基因fpk1预测蛋白的相似性比对
• 2.7 基因 fpk1 预测编码蛋白的结构分析
• 第二节 纤细齿梗孢一丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶基因 opk1 的克隆及序列分析
• 1 材料和方法
• 1.1 菌株
• 1.2 酶和生化试剂
• 1.3 主要仪器和设备
• 1.4 培养基、试剂与溶液
• 1.5 实验方法
• 1.5.1 引物设计
• 1.5.2 OPK1 基因中间片段的克隆
• 1.5.3 opk1 基因全长序列的克隆
• 2 结果与分析
• 2.1 opk1 中间片段的获得
• 2.2 蛋白激酶基因 opk15’端序列的克隆
• 2.3 opk1基因3’端克隆
• 2.4 全长序列的拼接与扩增
• 2.5 相似性比对与预测蛋白的结构及功能分析
• 第三节 轮枝镰孢和纤细齿梗孢 FUS3/KSS1 类 MAPK 基因的克隆与序列分析
• 1 实验材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 酶和生化试剂
• 1.2 主要仪器和设备
• 1.3 培养基、试剂与溶液
• 1.4 实验方法
• 1.4.1 引物设计
• 1.4.2 两基因中间片段的克隆
• 1.4.3 基因两端序列的克隆
• 1.4.4 基因全长 DNA 和 cDNA 序列的克隆
• 1.4.5 基因的同源性分析及功能预测
• 2 结果与分析
• 2.1 两基因中间片段的获得
• 2.2 两基因3’端序列的克隆
• 2.3 两基因5’末端序列的获得
• 2.4 两基因全长 DNA 和 cDNA 序列的克隆及分析
• 2.5 两基因的相似性分析
• 2.6 两基因预测蛋白的结构和功能分析
• 第四节 本章结论与讨论
• 1 结论
• 2 讨论
• 2.1 菌丝总RNA 的提取
• 2.2 PCR 引物设计
• 2.3 RACE 技术
• 2.4 TAIL-PCR 有关问题
• 2.5 PCR 常见问题及解决方案
• 第四章 轮枝镰孢两蛋白激酶 fpk1 和 fmk1 的功能研究
• 第一节 轮枝镰孢 cAMP 依赖的蛋白激酶 fpk1 的功能研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 仪器和设备
• 1.3 载体、酶、试剂和溶液等
• 1.4 方法
• 1.4.1 构建突变载体
• 1.4.1.1 策略
• 1.4.1.2 步骤及流程
• 1.4.2 原生质体制备和REMI 转化
• 1.4.3 转化子和突变体的筛选
• 1.4.4 Southern 杂交
• 1.4.4.1 试剂及溶液配置
• 1.4.4.2 杂交探针的制备
• 1.4.4.3 基因组 DNA 提取和酶切
• 1.4.4.4 电泳
• 1.4.4.5 印迹
• 1.4.4.5.1 凝胶处理
• 1.4.4.5.2 印迹
• 1.4.4.6 预杂交与杂交
• 1.4.4.7 洗膜与显影
• 1.4.5 蛋白激酶基因的 RT-PCR
• 1.4.6 突变体表型分析
• 1.4.6.1 菌落生长及菌丝分化状态观察
• 1.4.6.2 孢子产生及萌发情况分析
• 1.4.6.3 溶壁酶酶解菌丝比较
• 1.4.6.4 致病性测定
• 2 结果与分析
• 2.1 载体的构建
• 2.1.1 蛋白激酶基因全长DNA 序列的克隆
• 2.1.2 第一步重组
• 2.1.3 第二步重组
• 2.2 REMI 转化及突变体的筛选验证
• 2.3 Southern 杂交
• 2.4 蛋白激酶基因的 RT-PCR
• 2.5 突变体表型变化的研究
• 2.5.1 菌丝生长的变化
• 2.5.2 突变体产孢量能力的变化
• 2.5.3 孢子萌发与芽管伸长的变化
• 2.5.4 溶壁酶酶解菌丝的差别
• 2.5.5 对玉米幼苗致病性的变化
• 第二节 轮枝镰孢蛋白激酶基因 fmk1 的功能研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料和菌株
• 1.2 仪器和设备
• 1.3 载体、酶、试剂和溶液等
• 1.4 方法
• 1.4.1 构建突变载体
• 1.4.1.1 策略及流程
• 1.4.1.2 fmk1 基因上、下游片段的 PCR 扩增
• 1.4.1.3 第一步重组
• 1.4.1.4 第二步重组
• 1.4.2 原生质体制备和REMI 转化
• 1.4.3 转化子和突变体的筛选
• 1.4.4 Southern 杂交验证
• 1.4.5 蛋白激酶基因的 RT-PCR
• 1.4.6 突变体表型分析
• 1.4.6.1 菌落生长及菌丝分化状态观察
• 1.4.6.2 孢子产生及萌发情况分析
• 1.4.6.3 溶壁酶酶解及胞壁分化影响的分析
• 1.4.6.4 致病性测定
• 2 结果与分析
• 2.1 载体的构建
• 2.1.1 上下游基因片段的扩增
• 2.1.2 第一次重组
• 2.1.3 第二次重组
• 2.2 REMI 转化和敲除突变体的筛选
• 2.3 Southern 杂交结果
• 2.4 蛋白激酶基因的 RT-PCR
• 2.5 突变体表性分析
• 2.5.1 生长与形态变化
• 2.5.2 产孢量的变化
• 2.5.3 孢子萌发与芽管伸长的变化
• 2.5.4 致病性变化
• 第三节 本章结论和讨论
• 1 结论
• 2 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文