论文摘要
副结核病（Bovine Paratuberculosis）是由副结核分枝杆菌（Mycobacterium paratuberculosis）引起的一种全球性以反刍动物为主的慢性、消耗性传染病，也称Johne’s。该病主要引起牛、羊、鹿等反刍动物慢性、增生性肠炎，导致顽固性腹泻及慢性消耗，以致死亡。此外，也可引起猪、马等非反刍动物发病，现已成为饲养业严重流行的传染病之一。而且美国学者己从人类的克隆氏病患者体内分离出M.paratuberculosis。因此，Johne’s病愈来愈引起了世界各国的广泛关注。目前，预防该病的主要措施是控制传染源和加强饲养管理，即以副结核PPD进行检疫，对检出的阳性牛进行隔离与淘汰。此外，国内外也有采用预防接种的方法来控制该病，即将M.paratuberculosis热灭活或致弱后制成疫苗，免疫接种牛和羊，可降低该病的发生率。但是疫苗接种后会使动物血清转为阳性，干扰变态反应和血清学检测，并且在注射部位有时产生肉芽肿，以及对结核菌素敏感，妨碍牛结核病的变态反应检测，影响了牛的检疫和国际贸易。因此，许多政府禁止使用副结核菌苗及BCG来控制牛副结核病和结核病。可见，研究开发副结核病的新型疫苗和诊断试剂已迫在眉睫。研究表明，在短期培养过程中，副结核分枝杆菌分泌具有免疫活性的蛋白质，而在长期培养则相反。因此，早期分泌蛋白是主要的保护性抗原。由于DNA疫苗能有效地刺激机体产生持久的体液免疫和细胞免疫应答，同时，DNA疫苗免疫后，不干扰副结核病和牛结核病的变态反应检测。因此，研究新型DNA疫苗为预防副结核病提供了一条新途径。为了研制副结核病敏感、特异的诊断试剂和新型、高效的预防制剂，尤其是DNA疫苗，本研究筛选了M.paratuberculosis主要保护性抗原SOD基因，以M.paratuberculosis C-2染色体DNA为模板，以SOD基因的特异性引物进行PCR扩增，获得了624bp的SOD基因，通过T-A克隆技术，将PCR产物克隆至pMD18-T Vector中，以质粒大小、酶切分析、PCR扩增及序列分析鉴定重组克隆，成功地构建出克隆质粒pMD18-T-SOD，序列测定及DNASTAR分析表明，所获得的M.paratuberculosis C-2 SOD基因与Gen Bank中M.paratuberculosis K-10 SOD基因的大小完全一致，两者核苷酸序列的同源性为99％，氨基酸序列的同源性为99.5％，表明该基因在副结核分枝杆菌中是高度保守的。进一步将pMD18-T-SOD中的SOD基因亚克隆至pET-28a（+）原核表达系统中，构建了高效原核表达质粒pET-28a-SOD。在与之相匹配的E.coli BL21（DE3）中，该质粒经IPTG诱导获得了26.5kDa的融合蛋白。经免疫印迹分析证实，该融合蛋白具有副结核分枝杆菌抗原性。为进一步研究副结核分枝杆菌基因工程亚单位疫苗、核酸疫苗及诊断试剂奠定了基础。