凝血因子Ⅷ在毕赤酵母中的表达

论文摘要

人凝血因子Ⅷ（human coagulation factorⅧ,hFⅧ）在人凝血机制内部途径的级联反应中起着必不可少的作用,该因子的先天性缺陷会导致甲型血友病。目前,临床上治疗这种疾病多采用蛋白替代疗法,即输入含hFⅧ的制剂。世界上血友病患者众多,发病率在1/10000-3/10000。如此大的需求量单靠从血浆中提取无法满足市场的需求。因此,利用基因工程方法生产hFⅧ无疑具有巨大的商业价值。鉴于毕赤酵母自身强力的表达系统,本文利用毕赤酵母GS115为受体菌,筛选出能分泌重组人凝血因子Ⅷ（recombinant human coagulation factorⅧ,rhFⅧ）的基因工程菌株,并对该蛋白的发酵条件进行初步研究。本文在构建rhFⅧ基因工程菌时采用了适合该菌株的分泌型表达载体pPIC9,成功构建了重组表达质粒pPIC9-FⅧ。该质粒经SalI线性化,电转化整合入毕赤酵母GS115的染色体中。经基因组PCR筛选出阳性克隆,MM和MD平板筛选出His+Mut+表型,BMGY/BMMY培养基摇瓶振荡培养,SDS-PAGE鉴定培养物上清等步骤,最终得到能表达rhFⅧ的阳性菌株。对其表达模式的研究发现,随着诱导时间的延长,该蛋白的表达量增加,并在144h达到高峰。本论文通过BMGY/BMMY培养基摇瓶振荡培养对发酵条件进行了摸索。结果显示,在28℃,250rpm,每24h添加1%甲醇的诱导条件下rhFⅧ有微弱表达。以上结果表明,本研究利用毕赤酵母成功表达了hFⅧ蛋白,虽然表达量极低,但这为进一步研究hFⅧ在毕赤酵母中的高效表达打下了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 人凝血因子Ⅷ研究进展
• 1.1.1 人凝血因子Ⅷ简介
• 1.1.2 体内凝血机制
• 1.1.3 血友病A 与凝血因子Ⅷ
• 1.1.4 血浆中人凝血因子Ⅷ的分离纯化
• 1.1.5 重组人凝血因子Ⅷ国内外研究近况与应用前景
• 1.1.6 存在的问题
• 1.2 毕赤酵母表达系统研究进展
• 1.2.1 毕赤酵母表达系统简介
• 1.2.2 表达载体简介
• 1.2.3 载体与基因组的整合
• 1.2.4 外源蛋白的表达
• 1.2.5 影响外源基因表达的因素及提高蛋白表达的途径
• 1.2.6 展望
• 1.3 论文新颖性
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要实验材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 贮存液和培养基
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 人肝总RNA 的提取和反转录
• 2.2.2 PCR 扩增目的基因
• 2.2.3 FⅧ单段基因克隆载体的构建及鉴定
• 2.2.4 FⅧ双段基因克隆载体的构建及鉴定
• 2.2.5 FⅧ完整基因克隆载体的构建及鉴定
• 2.2.6 重组表达质粒pPIC9-FⅧ的构建及鉴定
• 2.2.7 毕赤酵母的转化
• 2.2.8 基因组PCR 法鉴定阳性重组子
• +Mut⁺阳性克隆'>2.2.9 MM 和MD 平板筛选His⁺Mut⁺阳性克隆
• 2.2.10 重组酵母菌的诱导表达
• 2.2.11 SDS-PAGE 电泳
• 3 结果
• 3.1 人肝总RNA 的提取和反转录
• 3.2 人凝血因子Ⅷ基因的克隆及测序
• 3.2.1 单段凝血因子Ⅷ基因的克隆及测序
• 3.2.2 双段凝血因子Ⅷ基因的克隆及测序
• 3.2.3 完整凝血因子Ⅷ基因的克隆及测序
• 3.3 重组表达载体pPIC9-FⅧ的构建及鉴定
• 3.4 重组质粒转入毕赤酵母后的验证
• +Mut⁺表型'>3.5 MM 和MD 平板筛选His⁺Mut⁺表型
• 3.6 重组人凝血因子Ⅷ的诱导表达及SDS-PAGE 检测
• 3.6.1 诱导时间对毕赤酵母表达重组人凝血因子Ⅷ的影响
• 3.6.2 诱导温度对毕赤酵母表达重组人凝血因子Ⅷ的影响
• 3.6.3 甲醇浓度及添加频率对毕赤酵母表达重组人凝血因子Ⅷ的影响
• 4 讨论
• 参考文献
• 总结与结论
• 攻读硕士学位期间参加的科研项目和发表论文
• 致谢