烟曲霉酸合成基因簇中后修饰基因的分析和应用研究

论文摘要

甾体药物生产过程中,微生物转化反应占有不可取代的地位,其中重要的反应有羟基化反应和C1,2位脱氢反应。产烟曲霉酸等甾型抗生素的真菌,例如烟曲霉和金龟子绿僵菌等,具有优良的甾体羟化和C1,2位脱氢能力。鉴于甾型抗生素与甾体药物在结构上具有相似性且在其甾核上具有C1,2位不饱和双键和多个羟基基团,因此在基因水平上分析烟曲霉酸等甾型抗生素的合成机理,有利于了解这些真菌在甾体药物转化方面的作用。本研究的目的是研究烟曲霉酸合成基因簇中后修饰基因的功能及其在甾体药物制备中的价值。1.金龟子绿僵菌中烟曲霉酸合成基因簇的克隆和基因功能分析金龟子绿僵菌是甾体药物羟化反应的常用菌,具有较高的烟曲霉酸生产水平。为了获得该菌的烟曲霉酸合成基因簇,我们构建了fosmid文库,根据已知烟曲霉基因组信息和金龟子绿僵菌EST标签库,利用了4对兼并引物,对fosmid文库进行了筛选,得到了3株阳性克隆子,经基因测序拼接,我们揭示了该菌23kb长的烟曲霉酸基因簇序列信息,并对其所含有的基因进行了分析。该基因簇包含1个甾核环化酶,1个3-甾酮-Δ1-脱氢酶,1个短链脱氢酶,2个乙酰转移酶,4个P450酶。该基因簇的基因构成与烟曲霉中烟曲霉酸基因簇类似。2.烟曲霉酸基因簇中P450基因的功能分析烟曲霉酸基因簇中4个P450酶的具体催化功能尚未得到鉴定,为了确定P450酶在烟曲霉酸合成过程中的具体功能,我们对其中一个P450基因进行了分析。通过农杆菌介导的真菌操作工具在烟曲霉中敲除了该P450基因,同步分析野生菌和敲除菌的发酵产物,HPLC检测结果显示,与野生型相比,敲除株不产烟曲霉酸也不产生可检测的其它烟曲霉酸衍生物,这表明该P450基因在烟曲霉酸的合成过程中起重要作用。3.烟曲霉酸基因簇中3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因在甾体药物转化方面的功能鉴定和酶学性质分析烟曲霉酸基因簇中的3-甾酮-△1-脱氢酶（ksdDF）基因被认为是催化烟曲霉酶酸C1,2位双键形成的基因,但其在3-甾酮-Δ4-烯类甾体药物的转化方面是否具有C1,2位脱氢功能,则尚未得到确认。烟曲霉中烟曲霉酸基因簇的ksdD基因（GeneID:3508866）编码596aa,分子量64.1795kD。对其氨基酸序列的分析发现,其与细菌来源的内在膜蛋白KsdD不同,该真菌源KsdDF是一个可溶性蛋白、无明显膜嵌入序列。将该基因在大肠杆菌E coli（λDE3）中进行表达并对其KsdD酶活进行定位,发现KsdD活性几乎全部存在于细胞上清中,表明该酶以可溶性的形式表现活性,而不是膜结合蛋白。以雄甾-4-烯-3,17-二酮（AD）为底物,该酶的Km值为2×10-4mol/l。将该基因在毕赤酵母GS115中进行表达并对KsdD酶活进行定位,同样发现KsdDF活性几乎全部存在于细胞上清中,印证了KsdDF是可溶性蛋白。虽然以pPIC3.5k载体对KsdDF进行胞内表达时,发现该酶表现很好的活性,但以pPIC9k载体对KsdDF进行胞外分泌表达时,该酶却不表现任何活性。KsdD通常被认为是膜界面蛋白,这一结果暗示在烟曲霉中KsdDF可能为外在膜蛋白或者其正确构型的形成需要膜起辅助作用。以AD为底物,毕赤酵母表达的KsdDF酶学动力学参数是：Km值为5×10-5mol/l,Vm值为51.68U/mg。4. KsdDF毕赤酵母工程菌的构建细菌来源的KsdD均有两段膜嵌入序列,为内在膜蛋白,异源表达多为包涵体,很难构建成功高活性异源表达基因工程菌。而KsdDF能在大肠杆菌和毕赤酵母中以可溶性高活性形式表达,表明其适合进行异源表达基因工程菌的构建。将ksdDF基因连接载体pPIC3.5K导入毕赤酵母KM71和GS115中,在摇瓶发酵水平上,重组KM71可以100%的转化率,将1.0g/l AD转化为雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（ADD）；重组GS115可以100%的转化率,将1.5g/lAD转化为ADD和宝丹酮（BD）,ADD和BD之间由酵母体内的17-羟基甾体脱氢酶可逆催化,由还原力决定,通过在发酵后期添加3%的葡萄糖可实现发酵产物中BD占ADD/BD混合物的80%（摩尔浓度）以上。以上毕赤酵母KM71和GS115重组菌显示了良好的ADD和BD生产能力,后续工作可对其进行过程工程放大研究。综上所述,本论文找到了金龟子绿僵菌合成烟曲霉酸基因簇,与烟曲霉基因簇相比较,虽然基因的相似性较低,但烟曲霉酸合成路径和基因组织形式相似。通过对基因簇中一个P450基因的研究,我们确定了该基因在烟曲霉酸合成中的重要作用,并为基因簇其他基因的鉴定奠定了方法学基础。通过对烟曲霉ksdDF的研究,我们发现了一种可溶性KsdD,并构建成功可高效转化AD积累ADD和BD的基因工程菌。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语对照表
• 第1章 前言
• 1.1 甾体药物与甾型抗生素
• 1.1.1 甾体化合物、甾体药物与甾型抗生素
• 1.1.2 甾型抗生素
• 1.1.3 产烟曲霉酸真菌烟曲霉和金龟子绿僵菌
• 1.1.3.1 烟曲霉（Aspergillus fumigatus）
• 1.1.3.2 金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）
• 1.1.3.3 产甾型抗生素的丝状真菌对甾体药物的生物转化作用
• 1.1.4 烟曲霉酸的生物合成机制与合成基因簇
• 1.1.5 甾型抗生素的后修饰反应在甾体转化方面潜在的价值
• 1.2 甾体药物的微生物转化
• 1.2.1 微生物转化在甾体药物制备中的重要地位
• 1.2.2 甾体微生物转化反应
• 1.2.2.1 甾体微生物转化类型
• 1.2.2.2 重要甾体微生物转化反应举例
• 1-脱氢酶（3-keto-Δ¹-dehydrogenase,KsdD）对甾体C1,2位的转化作用及其工业应用'>1.2.3 3-甾酮-Δ¹-脱氢酶（3-keto-Δ¹-dehydrogenase,KsdD）对甾体C1,2位的转化作用及其工业应用
• 1-脱氢酶的简介'>1.2.3.1 3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的简介
• 1-脱氢酶的催化机理'>1.2.3.2 3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的催化机理
• 1-脱氢酶的异源表达'>1.2.3.3 3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的异源表达
• 1.2.3.4 雄甾-4-烯-3,17-二酮和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮的研究进展
• 1.3 本课题的研究目的与内容
• 第2章 金龟子绿僵菌基因簇的获取和基因功能分析
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌株与载体
• 2.2.2 培养基及实验试剂
• 2.2.2.1 培养基
• 2.2.2.2 生化与分子生物学试剂
• 2.2.2.3 主要化学试剂
• 2.2.2.4 常用溶液的配制
• 2.2.3 菌种保藏
• 2.2.4 主要仪器
• 2.2.5 主要引物
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 金龟子绿僵菌基因组的提取
• 2.3.2 基因文库的构建
• 2.3.3 基因簇的钓取
• 2.3.3.1 基因文库中大肠杆菌的培养
• 2.3.3.2 克隆的鉴定
• 2.3.3.3 阳性克隆的测序和序列拼接
• 2.3.3.4 基因簇全长的获得
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 金龟子绿僵菌基因组的获得
• 2.4.2 基因簇的钓取
• 2.4.3 基因簇完整序列的获取
• 2.4.4 基因簇基因功能的推测以及与烟曲霉基因簇基因的比较
• 2.5 本章小结
• 第3章 农杆菌介导的烟曲霉P450基因敲除
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 菌株与材料
• 3.2.2 培养基及实验试剂
• 3.2.2.1 培养基
• 3.2.2.2 实验试剂
• 3.2.3 主要仪器
• 3.2.4 主要引物
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 烟曲霉基因组的提取
• 3.3.2 农杆菌介导质粒的构建
• 3.3.2.1 烟曲霉P450（Af4g14780）基因片段的克隆
• 3.3.2.2 PCR产物的纯化与回收
• 3.3.2.3 pPK2质粒的提取
• 3.3.2.4 P450基因片段RB’与pPK2载体的双酶切
• 3.3.2.5 RB’与pPK2载体的连接
• 3.3.2.6 感受态细胞的制备
• 3.3.2.7 连接产物转化大肠杆菌
• 3.3.2.8 阳性重组子的菌落PCR鉴定
• 3.3.2.9 阳性重组子的序列分析
• 3.3.2.10 含RB’阳性重组子的质粒提取
• 3.3.2.11 P450 LB’基因的克隆
• 3.3.2.12 阳性重组子与LB’的连接及验证
• 3.3.3 根癌农杆菌感受态细胞的制备
• 3.3.4 电转法转化RB’/LB’::pPK2入农杆菌GV3101感受态
• 3.3.5 烟曲霉孢子的获取
• 3.3.6 根癌农杆菌介导的转化
• 3.3.7 转化子的鉴定
• 3.3.8 烟曲霉P450敲除株产烟曲霉酸能力的检测
• 3.3.8.1 烟曲霉的培养和发酵产物的萃取
• 3.3.8.2 转化反应的HPLC分析
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 PCR扩增RB’和LB’
• 3.4.2 构建RB’/LB’::pPK2载体
• 3.4.3 转化子的鉴定
• 3.4.4 烟曲霉P450敲除株产烟曲霉酸能力的检测
• 3.5 本章小结
• 1-脱氢酶的异源表达以及高效转化AD的基因工程菌构建'>第4章 烟曲霉3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的异源表达以及高效转化AD的基因工程菌构建
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 菌株与载体
• 4.2.2 培养基和实验材料
• 4.2.2.1 培养基
• 4.2.2.2 实验试剂
• 4.2.3 主要仪器
• 4.2.4 主要引物
• 4.3 实验方法
• 1-脱氢酶（ksdD_F）在大肠杆菌（E.coli）中的表达基因的获取'>4.3.1 3-甾酮-Δ¹-脱氢酶（ksdD_F）在大肠杆菌（E.coli）中的表达基因的获取
• 4.3.1.1 烟曲霉基因组的提取
• 4.3.1.2 PCR扩增目的基因
• 4.3.1.3 PCR产物的纯化与回收
• 4.3.1.4 pET28（a）质粒的提取
• 4.3.1.5 PCR产物与pET28（a）载体的双酶切
• 4.3.1.6 目的基因与pET28（a）载体的连接
• 4.3.1.7 大肠杆菌DH5α或BL21（λDE3）感受态细胞的制备
• 4.3.1.8 连接产物转化大肠杆菌DH5a
• 4.3.1.9 阳性重组子的菌落PCR鉴定
• 4.3.1.10 阳性重组子的序列分析
• 4.3.1.11 重组质粒转化大肠杆菌BL21（λDE3）
• 4.3.1.12 阳性重组子的菌落PCR鉴定
• F跨膜结构的预测'>4.3.1.13 KsdD_F跨膜结构的预测
• 1-脱氢酶（ksdD_F）在大肠杆菌（E.coli）中的诱导表达'>4.3.2 3-甾酮-Δ¹-脱氢酶（ksdD_F）在大肠杆菌（E.coli）中的诱导表达
• F的诱导表达'>4.3.2.1 重组KsdD_F的诱导表达
• 4.3.2.2 表达产物的SDS-PAGE电泳鉴定
• F重组大肠杆菌的全细胞转化反应'>4.3.2.3 KsdD_F重组大肠杆菌的全细胞转化反应
• F重组大肠杆菌各细胞组分的酶活测定以及KsdD_F的酶活定位'>4.3.2.4 ksdD_F重组大肠杆菌各细胞组分的酶活测定以及KsdD_F的酶活定位
• F大肠杆菌表达酶动力学参数的测定'>4.3.2.5 KsdD_F大肠杆菌表达酶动力学参数的测定
• F）和GS115（pPIC3.5K-ksdD_F）的构建'>4.3.3 重组毕赤酵母KM71（pPIC3.5K-ksdD_F）和GS115（pPIC3.5K-ksdD_F）的构建
• 4.3.3.1 PCR引物的设计与合成
• 4.3.3.2 PCR扩增目的DNA
• 4.3.3.3 PCR产物的纯化与回收
• 4.3.3.4 pPIC3.5K质粒的提取
• 4.3.3.5 PCR产物与pPIC3.5K载体的双酶切
• 4.3.3.6 目的基因与pPIC3.5K载体的连接
• 4.3.3.7 大肠杆菌DH5α或BL21（λDE3）感受态细胞的制备
• 4.3.3.8 连接产物转化大肠杆菌DH5α
• 4.3.3.9 阳性重组子的菌落PCR鉴定
• 4.3.3.10 阳性重组子的序列分析
• 4.3.3.11 毕赤酵母KM71和GS115感受态细胞的制备和电转化构建
• 4.3.3.12 重组毕赤酵母的PCR鉴定以及阳性克隆子的基因型鉴定
• 4.3.4 毕赤酵母的诱导表达
• 4.3.4.1 生长曲线的测定
• 4.3.4.2 毕赤酵母的诱导表达
• 4.3.4.3 目的蛋白的电泳检测
• 4.3.4.4 工程菌的酶活检测
• 4.3.4.5 诱导条件的优化实验
• 4.3.4.6 工程菌最高转化能力的检测
• F重组毕赤酵母KM71_I和GS115_I各细胞组分的酶活测定以及KsdD_F的酶活定位'>4.3.4.7 ksdD_F重组毕赤酵母KM71_I和GS115_I各细胞组分的酶活测定以及KsdD_F的酶活定位
• F酶动力学参数的测定'>4.3.4.8 毕赤酵母表达KsdD_F酶动力学参数的测定
• I积累宝丹酮的优化'>4.3.4.9 毕赤酵母高产菌株GS115_I积累宝丹酮的优化
• F）和GS115（pPIC9K-ksdD_F）的构建'>4.3.5 重组毕赤酵母KM71（pPIC9K-ksdD_F）和GS115（pPIC9K-ksdD_F）的构建
• F和pPIC9K质粒的提取'>4.3.5.1 重组载体pPIC3.5K-ksdD_F和pPIC9K质粒的提取
• F与pPIC9K载体的双酶切'>4.3.5.2 重组载体pPIC3.5K-ksdD_F与pPIC9K载体的双酶切
• 4.3.5.3 目的基因与pPIC9K载体的连接
• F）和GS115（pPIC9K-ksdD_F）的构建'>4.3.5.4 重组毕赤酵母KM71（pPIC9K-ksdD_F）和GS115（pPIC9K-ksdD_F）的构建
• 4.3.6 毕赤酵母胞外表达的蛋白电泳和酶活检测
• 4.3.6.1 毕赤酵母胞外表达的蛋白电泳
• E和GS115_E的酶活测定'>4.3.6.2 毕赤酵母胞外表达重组KM71_E和GS115_E的酶活测定
• 4.4 结果与分析
• 1-脱氢酶（ksdD_F）在大肠杆菌（E.coli）中的表达基因的获取'>4.4.1 3-甾酮-Δ¹-脱氢酶（ksdD_F）在大肠杆菌（E.coli）中的表达基因的获取
• F的克隆'>4.4.1.1 烟曲霉ksdD_F的克隆
• F跨膜结构的预测'>4.4.1.2 KsdD_F跨膜结构的预测
• F'>4.4.1.3 在大肠杆菌中异源表达KsdD_F
• F的诱导表达及甾体药物转化活性'>4.4.2 ksdD_F的诱导表达及甾体药物转化活性
• F的诱导表达'>4.4.2.1 ksdD_F的诱导表达
• F对AD的全细胞转化'>4.4.2.2 BL21-pET28a-ksdD_F对AD的全细胞转化
• F的酶活定位分析'>4.4.2.3 细胞中KsdD_F的酶活定位分析
• F酶动力学参数的测定'>4.4.2.4 大肠杆菌表达的KsdD_F酶动力学参数的测定
• F）和GS115（pPIC3.5K-ksdD_F）的构建'>4.4.3 重组毕赤酵母KM71（pPIC3.5K-ksdD_F）和GS115（pPIC3.5K-ksdD_F）的构建
• F基因的克隆'>4.4.3.1 烟曲霉ksdD_F基因的克隆
• F::pPIC3.5K载体及毕赤酵母转化'>4.4.3.2 构建ksdD_F::pPIC3.5K载体及毕赤酵母转化
• F在毕赤酵母中的胞内表达'>4.4.4 KsdD_F在毕赤酵母中的胞内表达
• 4.4.4.1 生长曲线的测定
• 4.4.4.2 毕赤酵母的诱导表达及目的蛋白的电泳检测
• 4.4.4.3 诱导条件的优化实验
• 4.4.4.4 转化能力检测
• I和GS115_I转化AD生成BD的鉴定'>4.4.4.5 KM71_I和GS115_I转化AD生成BD的鉴定
• F在KM71_I和GS115_I中的酶活定位'>4.4.4.6 KsdD_F在KM71_I和GS115_I中的酶活定位
• F酶学动力学参数的测定'>4.4.4.7 毕赤酵母表达KsdD_F酶学动力学参数的测定
• F在KM71（pPIC9K-ksdD_F）和GS115（pPIC9K-ksdD_F）中的胞外表达'>4.4.5 ksdD_F在KM71（pPIC9K-ksdD_F）和GS115（pPIC9K-ksdD_F）中的胞外表达
• 4.4.5.1 ksdDF::pPIC9K载体的构建
• 4.4.5.2 毕赤酵母电转化
• F毕赤酵母的胞外表达'>4.4.6 KsdD_F毕赤酵母的胞外表达
• 4.4.6.1 毕赤酵母的诱导表达及目的蛋白的电泳检测
• E和GS115_E酶活的检测'>4.4.6.2 重组KM71_E和GS115_E酶活的检测
• 4.5 本章小结
• 第5章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 课题展望
• 参考文献
• 致谢