论文摘要
近几十年来，辅助生育技术得到了快速发展，已经成为治疗不孕不育症的重要手段之一。胚胎冷冻技术在人类辅助生育技术中具有重要作用。通过胚胎冷冻保存，可以增加进行体外受精-胚胎移植妇女的妊娠机会；有利于临床上控制移植的胚胎数，从而减少多胎妊娠；可以根据患者具体情况选择移植时间，减少严重卵巢过度刺激综合征；可以避免多余胚胎的浪费，减少治疗费用。长期以来，提高冷冻胚胎的存活率和发育潜力一直研究者们关注的热点。本课题采用细胞培养、胚胎冷冻技术、激光辅助孵化、显微操作技术、激光共聚焦显微技术进行以下几个方面研究：不同冷冻保护剂冷冻早期胚胎的效果；不同冷冻方式冷冻早期胚胎的效果；激光辅助孵化结合显微操作去除冷冻胚胎坏死细胞对其发育潜力的影响；胚胎冷冻对小鼠胚胎细胞骨架结构的影响。结果如下：采用慢速冷冻方式冷冻2～8-细胞小鼠胚胎，胚胎解冻后，以丙二醇作冷冻保护剂的胚胎存活率、囊胚形成率和囊胚孵出率显著高于以二甲基亚砜、甘油分别作冷冻保护剂的结果（P＜0.05）；但与以乙二醇作冷冻保护剂的结果相比没有显著差异（P＞0.05）。以二甲基亚砜、甘油和乙二醇3种冷冻保护剂分别冷冻2～8-细胞小鼠胚胎，解冻后胚胎存活率、囊胚形成率和囊胚孵出率没有显著差异（P＞0.05）。采用玻璃化冷冻仪冷冻小鼠2～8-细胞胚胎时，解冻后胚胎存活率、囊胚形成率和囊胚孵出率，以乙二醇作冷冻保护剂的结果显著高于以丙二醇、二甲基亚砜和甘油分别作冷冻保护剂的结果（P＜0.05），以丙二醇、二甲基亚砜和甘油3种冷冻保护剂分别冷冻2～8-细胞小鼠胚胎，解冻后胚胎存活率、囊胚形成率和囊胚孵出率没有显著差异（P＞0.05）。以乙二醇作冷冻保护剂采用Vit-Master玻璃化冷冻方式冷冻小鼠2～8-细胞胚胎的胚胎存活率、囊胚形成率和囊胚孵出率，与以丙二醇作冷冻保护剂采用慢速冷冻-快速解冻方式冷冻小鼠2～8-细胞胚胎的结果没有显著性差异（P＞0.05）。小鼠冷冻胚胎解冻后，细胞完整的冷冻胚胎采用激光辅助孵化与未采用激光辅助孵化的囊胚形成率（分别为71.95％和70.11％）没有显著差异（P＞0.05），但采用激光辅助孵化的囊胚孵出率（63.41％）却显著高于未采用激光辅助孵化的胚胎（48.28％）（P＜0.05）。卵裂球细胞完整的胚胎的囊胚形成率（71.95％）和囊胚孵出率（63.41％）显著高于部分卵裂球细胞损伤的胚胎（分别为52.94％和41.18％）（P＜0.05）。在部分细胞损伤的冷冻胚胎中，采用激光辅助孵化结合显微操作去除坏死细胞与对照组相比，其囊胚形成率（分别为52.94％和32.00％）和囊胚孵出率（分别为41.18％和22.00％）均得到了显著的提高（P＜0.05）。在回顾性分析成都市计划生育技术指导所人类冷冻胚胎移植周期中，对冷冻胚胎进行激光辅助孵化的患者的临床妊娠率（24.00％）和胚胎植入率（10.29％），与没有进行激光辅助孵化的患者的临床妊娠率（22.22％）和胚胎植入率（10.17％）相比没有显著差异（P＞0.05）。同时移植细胞完整和部分细胞损伤冷冻胚胎的临床妊娠率（22.22％）和胚胎植入率（10.17％）显著高于仅移植部分细胞损伤的冷冻胚胎临床妊娠率（5.88％）和胚胎植入率（2.82％）（P＜0.05）。采用激光辅助孵化结合显微操作去除冷冻胚胎的坏死细胞碎片后，冷冻胚胎移植的临床妊娠率（43.90％）和胚胎植入率（19.44％）显著高于没有去除冷冻胚胎坏死细胞碎片的临床妊娠率（24.00％）和胚胎植入率（10.29％）（P＜0.05）。用抗骨架蛋白actin的单克隆抗体分别对冷冻前、后小鼠2-细胞和4-细胞胚胎进行免疫染色，激光共聚焦显微镜观察。荧光强度定量分析表明小鼠2-细胞冷冻胚胎的荧光强度（169.67±8.50）与未冷冻胚胎的荧光强度（180.83±9.06）相比，没有显著性差异（P＞0.05）；小鼠4-细胞冷冻胚胎的荧光强度（175.43±11.50）与未冷冻4-细胞胚胎的荧光强度（162.67±10.41）相比，也没有显著性差异（P＞0.05）。提示冷冻对小鼠早期胚胎的细胞骨架结构没有明显影响。上述结果表明，采用慢速冷冻-快速解冻方式冷冻小鼠2～8-细胞胚胎，以丙二醇作冷冻保护剂较为理想；采用Vit-Master玻璃化冷冻小鼠2～8-细胞胚胎，乙二醇作冷冻保护剂最为理想，而且该方式有可能成为慢速冷冻-快速解冻的替代方法；激光辅助孵化可提高小鼠冷冻胚胎的孵化能力；激光辅助孵化结合显微操作去除冷冻胚胎的坏死细胞，可提高小鼠冷冻胚胎的发育潜力和人类冷冻胚胎移植的临床妊娠率和胚胎植入率；冷冻对小鼠2-细胞和4-细胞胚胎的细胞骨架结构没有明显影响。本研究将为胚胎冷冻保存技术的临床应用提供有价值的实验依据。
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