柑橘体细胞杂种细胞遗传学及抗CTV等基因对枳的FISH分析

论文题目: 柑橘体细胞杂种细胞遗传学及抗CTV等基因对枳的FISH分析

论文类型: 博士论文

论文专业: 果树学

作者: 陈春丽

导师: 邓秀新

关键词: 柑橘,体细胞杂种,减数分裂,育性,原位杂交,遗传重组,物理定位

文献来源: 华中农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 柑橘体细胞杂种为砧木和接穗品种改良提供了丰富的材料。原位杂交技术是对杂种染色体组成进行鉴别和对基因进行染色体物理定位的一种非常有效的分子细胞遗传学技术。本实验对已开花柑橘体细胞杂种及其亲本的花粉母细胞染色体减数分裂行为以及花粉育性进行了研究;完善了适用于柑橘材料的基因组原位杂交技术,对6例柑橘属间有性或体细胞杂种的核基因组组成进行了分析;并应用FISH技术对抗CTV、rDNA、copia-like反转录转座子、多聚半乳糖醛酸酶(PG)等基因在枳染色体上的物理定位进行了研究。主要研究结果如下: 1 采用花粉母细胞酶解压片法,观察了6个柑橘体细胞杂种及其5个亲本的花粉母细胞染色体减数分裂行为,发现柑橘异源四倍体体细胞杂种减数分裂较其亲本复杂。体细胞杂种中染色体同源配对构型多样,单价体与多价体出现比例高,染色体排在赤道板外,后期形成染色体桥以及染色体落后等异常行为频率较高。但印度酸橘与阿根廷枳(Citrus reticulata+Poncirus trifoliata)属间组合例外,其减数分裂正常,染色体同源配对构型为二价体,类似于二倍体,且少有染色体异常行为。二倍体胞质杂种佩奇橘柚(?)粗柠檬[(C.reticulate×C.paradisf)+C.jambhiri]减数分裂中的染色体行为比其亲本出现了更多异常现象。 2 对8个体细胞杂种和6个亲本的正常四分体比例、小花粉比率、花粉染色活力、体外萌发率以及芘粉粒大小进行观察统计,分析其花粉育性,发现柑橘异源四倍体体细胞杂种的小花粉比率显著高于融合亲本,花粉萌发率介于双亲之间。异源六倍体体细胞杂种锦橙+HR [C.sinensis+(C.sinensis+C.jambhiri)]和二倍体胞质杂种佩奇橘柚(?)粗柠檬[(C.reticulata×C.paradisi)+C.ambhiri]的花粉萌发率分别为3.7%和6.8%,低于各自双亲。 3 优化了柑橘基因组原位杂交的技术条件。采用去壁低渗—火焰干燥法获取染色体制片,切口平侈法标记探针,点印渍法检测探针标记效果,煮沸方法打断封阻总DNA,探针与封阻DNA的浓度比例为1:50时,能有效地分开属间有性杂种枳橙和枳柚中来自双亲的染色体。 4 以枳总DNA为探针,对甜橙染色体进行GISH分析,检测枳(P.trifoliata)与甜橙(C.sinensis)基因组之间的同源性,结果显示甜橙中有5对染色体与枳基因组存在较高的同源性。 5 采用GISH技术分析4个组合的柑橘属间四倍体体细胞杂种的核遗传组成,结

论文目录:

摘要

Abstract

缩略词表

第一章文献综述与本研究的目的

1 植物体细胞杂交的研究进展

1.1 植物体细胞杂交研究概况

1.2 植物体细胞杂种鉴定方法的发展

1.2.1 形态学鉴定

1.2.2 细胞学鉴定

1.2.3 生物化学方法分析

1.2.4 分子生物学检测

1.3 柑橘体细胞杂交的研究进展

1.3.1 柑橘体细胞杂种的遗传分析

1.3.2 柑橘体细胞杂种的表现及其在遗传改良上的应用

2 植物染色体原位杂交技术的研究进展

2.1 原位杂交技术概述

2.2 植物染色体原位杂交技术的发展及应用

2.2.1 植物染色体原位杂交技术的发展

2.2.1.1 染色体制片技术的发展

2.2.1.2 探针及其标记检测系统的发展

2.2.1.3 与其它技术的结合

2.2.2 染色体原位杂交技术在植物上的应用

2.2.2.1 外源染色质(体)、多种染色体畸变的检测

2.2.2.2 在构建植物染色体物理图谱上的应用

2.2.2.3 物种起源进化及物种间亲缘关系的分析

2.2.2.4 植物基因工程及基因表达研究

2.2.2.5 比较基因组分析

2.2.3 染色体原位杂交技术与植物体细胞杂种遗传鉴定

2.2.3.1 倍性变异来源检测

2.2.3.2 非对称程度确认

2.2.3.3 亲核基因组互作

2.2.3.4 减数分裂时期染色体行为

2.2.3.5 融合双亲染色体在有性后代中的传递

2.2.4 FISH在基因的物理定位上的应用

3 柑橘细胞遗传学研究进展

4 柑橘抗CTV基因的研究进展

5 本研究的目的与内容

第二章柑橘体细胞杂种及其亲本的细胞遗传学研究

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 本研究所选用的柑橘体细胞杂种

2.1.2 SSR分析所使用的引物

2.2 方法

2.2.1 倍性分析

2.2.2 花粉母细胞的减数分裂观察

2.2.3 花粉的育性检测

2.2.3.1 花粉量测定

2.2.3.2 花粉染色活力

2.2.3.3 花粉萌发

2.2.4 总DNA提取

2.2.5 SSR分析

3 结果与分析

3.1 形态学观察

3.2 倍性确定

3.3 偑奇橘柚与粗柠檬组合再生植株的鉴定SSR分析核基因组

3.4 柑橘体细胞杂种及其亲本减数分裂时期染色体行为分析

3.4.1 减数分裂中期花粉母细胞的染色体联会构型情况

3.4.1.1 二倍体亲本减数分裂中期染色体的配对情况

3.4.1.2 体细胞杂种组合减数分裂中期染色体的配对情况

3.4.2 减数分裂过程中染色体的异常行为

3.4.2.1 二倍体亲本减数分裂过程中染色体的异常行为

3.4.2.2 体细胞杂种组合减数分裂过程中染色体的异常行为

3.5 柑橘体细胞杂种及其亲本的花粉育性

3.5.1 亲本的花粉育性

3.5.2 柑橘体细胞杂种的花粉育性

4 讨论

4.1 柑橘体细胞杂种在减数分裂过程中发生染色体异常行为的原因

4.2 柑橘体细胞杂种的花粉育性与其亲本比较

4.3 柑橘体细胞杂种的育性与遗传改良

第三章柑橘属间杂种的GISH分析

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 方法

2.2.1 染色体片制备

2.2.2 总DNA提取

2.2.3 探针标记

2.2.4 杂交和检测

2.2.5 照相和图像分析

3 结果与分析

3.1 GISH技术体系的建立

3.1.1 去壁低渗-火焰干燥法染色体制片

3.1.2 打断封阻总DNA方法

3.1.3 探针标记的方法

3.1.4 标记基因组总DNA与封阻基因组总DNA浓度比例确定

3.1.5 染色体复染

3.2 应用GISH鉴定柑橘属间有性杂种枳橙和枳柚

3.3 基因组原位杂交比较枳与甜橙的基因组同源性

3.4 GISH分析体细胞杂种枸头橙+枳核基因组

3.5 GISH确定3个柑橘属间组合的杂种地位

4 讨论

4.1 提高制片技术扩展染色体的来源

4.2 GISH技术方法

4.3 GISH技术在柑橘上的应用前景

4.4 枳和橙以及枳和柚的亲缘关系讨论

4.5 柑橘体细胞杂种的染色体重组现象

4.6 CISH技术分析柑橘体细胞杂种的应用潜力

第四章抗CTV及其它几个基因在枳中的FISH作图

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 方法

2.2.1 总DNA提取

2.2.2 Cot—1 DNA提取

2.2.2 探针制备

2.2.3.1 抗CTV基因探针制备

2.2.3.1.1 质粒DNA提取

2.2.3.1.2 PCR检测

2.2.3.2 rDNA基因探针制备

2.2.3.3 反转录转座子copia-like基因探针制备

2.2.3.4 PG基因探针制备

2.2.3.4.1 引物设计

2.2.3.4.2 PCR扩增

2.2.3.4.3 特异带的回收

2.2.3.4.4 PCR产物的TA克隆、测序与序列分析

2.2.4 随机引物法标记探针

2.2.5 原位杂交和检测，照相及图像分析

2.2.6 Southern杂交

2.2.6.1 DNA酶切与电泳分离

2.2.6.2 Southern印迹

2.2.6.3 探针标记、杂交与洗膜

3 结果与分析

3.1 Cot—1 DNA对枳染色体的原位杂交分析

3.1.1 Cot—1 DNA的获得

3.1.2 Cot—1 DNA对枳染色体的FISH分析

3.2 抗CTV基因在枳染色体上的物理定位

3.2.1 含抗CTV基因的TAC、BAC克隆在枳中的FISH定位

3.2.2 pt-8在枳中的FISH定位

3.3 rDNA基因的FISH分析

3.4 反转录转座子copia-like基因的FISH分析

3.5 PG基因的克隆及定位

3.5.1 PG基因的分离与克隆

3.5.2 PG基因的染色体物理定位

4 讨论

4.1 TAC、BAC克隆与单拷贝基因分别用作探针对FISH定位基因的比较

4.2 rDNA基因在柑橘基因组上的分布

4.3 反转录转座子copia-like基因的定位

4.4 PG基因的定位

4.5 FISH定位基因在柑橘作物上的局限性

参考文献

图版和说明

致谢

攻读博士学位期间发表论文

发布时间: 2005-12-05

参考文献

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