铅镉联合对新生大鼠中枢神经系统的毒性损伤及NAC保护效应的研究

论文摘要

近年来,对环境化学物毒性危害的研究已由原来单一因素为主向因素间联合作用方向发展。铅、镉均是生产和生活中接触频率大、暴露范围广的蓄积性毒物,能对发育中的中枢神经系统产生重要影响。铅、镉单独作用的报道较多,而对两者的联合毒性研究则相对较少,尤其是铅镉联合对处于发育早期的动物中枢神经系统毒性损伤的系统研究较为罕见。本研究选用新生大鼠作为试验动物,通过体外和体内实验相结合的方法较系统的探讨了铅、镉及其联合对新生大鼠中枢神经系统的毒性损伤效应及其可能的作用机理,为进一步认识铅、镉及其联合毒性作用提供理论依据。一、体外试验选用新生24h内SD大鼠作为试验用神经细胞的来源,采用尼氏染色对皮质神经细胞进行了形态鉴定和纯度分析,用CCK-8法检测了一个生长周期内神经细胞的活性分布,成功建立了大脑皮质神经细胞毒性试验的体外培养模型:在此基础上,在培养液中添加不同浓度的Pb、Cd,共分9组,分别为对照组、P1（Pb100μmol/L）、P2（Pb 200μmol/L）、C1（Cd 5μmol/L）、C2（Cd 10μmol/L）、P1C1（Pb100μmol/L+Cd 5μmol/L）、P1C2（Pb 100μmol/L+Cd 10μmol/L）、P2C1（Pb 200μmol/L+Cd 5μmol/L）、P2C2（Pb 200μmol/L+Cd 10μmol/L）组。分别从神经细胞形态学、神经细胞存活率、神经细胞凋亡率以及神经细胞GSH-Px、SOD、CAT、TChE活性和MDA含量等方面对铅、镉损伤新生大鼠大脑皮质神经细胞进行了研究;同时,添加N-乙酰半胱氨酸（NAC）,观察其在铅镉损伤神经细胞过程中的保护效果。结果表明,①本试验培养的大脑皮质神经细胞,经尼氏染色鉴定并计数神经细胞纯度在92%以上,且在一个生长周期内培养至第6d时神经细胞的OD值最高,因此,本试验将第6d确定为铅镉处理神经细胞的时间;②与对照组相比,铅、镉及其联合均能导致神经细胞数量减少、网络减少或消失;能使胞体短直径和突起长度显著变小和缩短（P＜0.05）;使神经细胞的存活率显著下降（P＜0.05）,且具有明显的时间与剂量效应;各染毒组神经细胞核皱缩、呈新月形、染色质致密浓染,甚至出现核碎裂,细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）;与相应单独染毒组比较,各联合染毒组上述指标变化更为严重,P1C2组较P2C1组改变明显,其中以P2C2组最为显著（P＜0.05）;③与对照组比较,各染毒组神经细胞GSH-Px、SOD、TChE活性均显著下降（P＜0.05）,而CAT活性和MDA含量则显著升高（P＜0.05）;④在NAC拮抗铅、镉及其联合毒性试验中,可以看出NAC能使神经细胞存活率升高、细胞凋亡率下降,能使GSH-Px、SOD、TChE、CAT活性升高及MDA含量下降,但无显著性差异（P＞0.05）。由上述试验结果可以得出以下结论:①铅、镉及其联合能使神经细胞胞体变小,神经细胞突起变短,神经细胞间网络连接减少;能使神经细胞存活率下降,神经细胞凋亡率增加,且具有明显的时间和剂量效应。铅镉联合表现协同毒性效应,其中镉在联合作用中发挥主导作用;②铅、镉及其联合能显著改变神经细胞GSH-Px、SOD、CAT、TChE活性和MDA含量,因此,铅、镉的神经系统毒性与其脂质过氧化损伤有关;③添加NAC可以提高神经细胞的存活率,减少凋亡细胞的数量,增加GSH-Px、SOD、CAT、TChE活性,减少MDA的生成,说明NAC具有一定的拮抗铅、镉毒性损伤的作用,但保护效果不明显。二、体内试验35只怀孕母鼠被随机分为7组,分别为对照组（饮用蒸馏水）、铅组（300mg/L）、铅+NAC组（300mg/L+20mmol/L）、镉组（10mg/L）、镉+NAC组（10mg/L+20mmol/L）、铅镉联合组（300mg/L+10mg/L）、铅镉联合+NAC组（300mg/L+10mg/L+20mmol/L）。经饮水染毒,染毒时间为整个妊娠期,待分娩后观察并记录:①铅、镉及其联合对新生鼠生长发育的影响;②用光学显微镜、透射电子显微镜观察新生鼠大脑皮质组织病理学及超微结构的变化;③测定新生鼠脑组织GSH-Px、SOD、CAT、TChE活性及MDA含量;④ICP-MS检测了新生鼠体内主要微量元素Cu、Fe、Zn、Mn及Se含量;⑤FQ-PCR法检测了凋亡基因bcl-2、Bax和c-fos在新生鼠大脑皮质中的表达;免疫组织化学和FQ-PCR法检测了MT-3在新生鼠大脑皮质中的表达研究;⑥同时进行了相关指标的NAC保护试验研究。结果表明,①与对照组比较,各染毒组新生鼠体重和脑重均明显下降（P＜0.05或P＞0.05）,其中以铅镉联合组降低最为明显;②新生鼠大脑皮质组织经HE染色未见明显异常的病理组织学变化,但超微结构变化明显,表现神经细胞核固缩、变形,染色质边聚、轻度溶解,线粒体肿胀、嵴部分或完全消失,铅镉联合对新生鼠大脑皮质超微结构的损伤较铅、镉单独时严重;③各染毒组新生鼠体内微量元素Cu、Fe、Zn、Mn和Se含量均显著低于对照组（P＜0.05）,以铅镉联合组降低最为明显;④与对照组相比,铅、镉及其联合均使新生鼠脑组织GSH-Px、SOD、TChE、CAT活性下降及MDA含量升高（P＜0.05或P＞0.05）;⑤各染毒组新生鼠大脑皮质bcl-2基因的表达均低于对照组（P＜0.05或P＞0.05）,而Bax、c-fos和MT-3表达则显著高于对照组（P＜0.05）;⑥NAC保护组与相应染毒组比较,新生鼠体内微量元素Cu、Fe、Zn、Mn和Se含量均有所升高（P＜0.05或P＞0.05）,脑组织GSH-Px、SOD、TChE、CAT活性均有不同程度升高但差异不显著（P＞0.05）,MDA含量则显著下降（P＜0.05）,大脑皮质bcl-2基因的表达量明显增加（P＜0.05或P＞0.05）,而Bax和c-fos表达则显著减少（P＜0.05）。通过对本部分试验结果的分析,可得出以下结论:①母鼠妊娠期铅、镉及其联合暴露能明显减轻新生鼠体重和脑重,导致新生鼠脑发育迟缓;②母鼠妊娠期铅、镉及其联合暴露对新生鼠大脑皮质超微结构有显著影响,导致细胞膜破裂,细胞核固缩、变形,线粒体肿胀、嵴部分或完全消失;③铅、镉及其联合导致机体抗氧化酶活性降低可能与其微量元素Cu、Fe、Zn、Mn和Se含量下降有关;④铅、镉及其联合诱导神经细胞凋亡与bcl-2、Bax、c-fos基因的异常表达有关,铅镉联合表现协同毒性效应;⑤母鼠妊娠期铅、镉及其联合暴露的同时添加NAC可以提高新生鼠体重和脑重,新生鼠体内微量元素的含量增加,使新生鼠脑组织内GSH-Px、SOD、CAT、TChE活性升高,MDA含量显著降低,能增加bcl-2的表达量、减少Bax、c-fos和MT-3的表达量,表明NAC对铅、镉毒性损伤具有一定的保护作用。

论文目录

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缩略词表

第一部分文献综述

第一节铅的毒性及作用机理研究进展

第二节镉的毒性及作用机理研究进展

第三节铅镉联合毒性作用及机理研究进展

第四节 N-乙酰半胱氨酸拮抗重金属毒性作用及其机理

第二部分体外试验研究

第一章新生大鼠大脑皮质神经细胞原代培养方法的建立及活性鉴定

1 材料

1.1 实验动物

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2 方法

2.1 溶液的配制

2.2 培养板包被处理

2.3 大脑皮质神经细胞的分离及培养

2.4 大脑皮质神经细胞的形态学观察

2.5 大脑皮质神经细胞的纯度鉴定-Nissl's染色

2.6 大脑皮质神经细胞的活性鉴定-CCK-8法

3 结果

3.1 大脑皮质神经细胞的形态学观察

3.2 Nissl's染色结果

3.3 CCK-8法测定神经细胞活性

4 讨论

第二章铅镉联合对新生大鼠大脑皮质神经细胞的毒性损伤作用

1 材料

1.1 实验动物

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2 方法

2.1 各试验组铅镉及其联合的作用浓度

2.2 大脑皮质神经细胞培养及染毒

2.3 大脑皮质神经细胞的形态学观察

2.4 大脑皮质神经细胞存活率的测定

2.5 大脑皮质神经细胞凋亡的形态学观察及凋亡率的测定

2.6 数据分析

3 结果

3.1 铅镉对大脑皮质神经细胞的形态学影响

3.2 铅镉对大脑皮质神经细胞存活率的影响

3.3 铅镉对大脑皮质神经细胞凋亡的形态学影响

3.4 铅镉对大脑皮质神经细胞凋亡率的影响

4 讨论

第三章铅镉联合对大脑皮质神经细胞的脂质过氧化损伤

1 材料

1.1 实验动物

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2 方法

2.1 各试验组铅镉及其联合的作用浓度

2.2 大脑皮质神经细胞培养及染毒

2.3 谷胱甘肽过氧化物酶活性测定

2.4 超氧化物歧化酶活性测定

2.5 乙酰胆碱酯酶活性测定

2.6 过氧化氢酶活性测定

2.7 丙二醛含量测定

2.8 数据分析

3 结果

4 讨论

第四章 NAC对铅镉联合致大脑皮质神经细胞损伤的保护效应

1 材料

1.1 实验动物

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2 方法

2.1 主要溶液的配制

2.2 大脑皮质神经细胞培养及分组

2.3 大脑皮质神经细胞存活率的测定

2.4 大脑皮质神经细胞凋亡率的测定

2.5 大脑皮质神经细胞GSH-Px、SOD、TChE、CAT活性及MDA含量的测定

2.6 数据分析

3 结果

3.1 NAC对大脑皮质神经细胞存活率的影响

3.2 NAC对大脑皮质神经细胞凋亡的影响

3.3 NAC对大脑皮质神经细胞GSH-Px、SOD、TChE、CAT活性及MDA含量的影响

4 讨论

第三部分体内试验研究

第一章铅镉联合对新生大鼠脑生长发育的影响

1 材料

1.1 实验动物

1.2 主要试剂和仪器

2 方法

2.1 毒液的配制

2.2 试验分组及染毒

2.3 数据分析

3 结果

3.1 妊娠期大鼠一般情况及体重变化

3.2 新生鼠一般情况及体重变化

4 讨论

第二章铅镉联合对新生大鼠大脑皮质损伤的病理学研究

1 材料

1.1 实验动物

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2 方法

2.1 试验分组及染毒

2.2 新生大鼠大脑皮质组织学观察

2.3 新生大鼠大脑皮质组织超微结构观察

3 结果

3.1 脑脏器系数的变化

3.2 光镜观察

3.3 透射电镜观察

4 讨论

第三章铅镉联合对新生大鼠体内微量元素含量的影响

1 材料

1.1 实验动物

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2 方法

2.1 玻璃器皿的准备

2.2 稀释液的制备

2.3 标准溶液的制备

2.4 样品的采集与处理

2.5 微波消解样品

2.6 耦合等离子体质谱仪工作条件

2.7 电感耦合等离子体质谱仪工作标准曲线参数

2.8 数据分析

3 结果

3.1 新生鼠体内铅镉含量的测定

3.2 铅镉对新生鼠体内微量元素含量的影响

4 讨论

第四章铅镉联合对新生大鼠脑氧化损伤的研究

1 材料

1.1 实验动物

1.2 主要试剂

2 方法

2.1 脑组织匀浆的制备

2.2 检测方法

2.3 数据分析

3 结果

4 讨论

第五章铅镉联合对新生大鼠脑bcl-2、Bax和c-fos表达的影响

1 材料

1.1 实验动物

1.2 主要仪器

1.3 主要试剂

2 方法

2.1 采样前的准备

2.2 样品的采集

2.3 RNA的提取

2.4 新生大鼠大脑bcl-2、Bax、c-fos mRNA的RT-PCR分析

2.5 数据分析

3 结果

3.1 总RNA的检测

3.2 新生大鼠大脑bcl-2、Bax、c-fos mRNA的实时荧光定量检测

4 讨论

第六章 NAC对铅镉致新生大鼠毒性损伤的保护效应

1 材料

1.1 实验动物

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器设备

2 方法

2.1 微量元素Cu、Fe、Zn、Se和Mn含量的测定

2.2 GSH-Px、SOD、CAT、TChE活性及MDA含量的测定

2.3 凋亡相关基因bcl-2、Bax和c-fos表达检测

2.4 数据分析

3 结果

3.1 微量元素Cu、Fe、Zn、Mn和Se含量的变化

3.2 GSH-Px、SOD、CAT、TChE活性及MDA含量的变化

3.3 凋亡相关基因bcl-2、Bax、c-fos表达的检测结果

4 讨论

第七章铅镉联合对新生大鼠脑金属硫蛋白-Ⅲ（MT-3）表达的影响

1 材料

1.1 实验动物

1.2 主要仪器与试剂

2 方法

2.1 采样前的准备

2.2 器皿的处理

2.3 载玻片的包被

2.4 样品的采集

2.5 铅镉对新生大鼠MT-3诱导表达的免疫组化试验

2.6 RNA的提取

2.7 新生大鼠大脑MT-3 mRNA的RT-PCR分析

2.8 数据分析

3 结果

3.1 铅镉诱导新生大鼠大脑皮质MT-3表达的免疫组化试验

3.2 新生大鼠大脑MT-3 mRNA的实时荧光定量检测

4 讨论

结论

参考文献

附图

攻读博士学位期间发表文章

致谢

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