人脐血干细胞海马移植治疗血管性痴呆大鼠及GM1对其影响

论文摘要

目的:血管性痴呆（vascular dementia,VD）是指由各种脑血管病（cerebrovascular disease,CVD）包括梗死、出血和低灌注等导致的痴呆综合征。VD在卒中病人中发病率约为12%～36.3%,居各类痴呆发病原因的第二位。VD患者的生活质量和生存期限受到严重影响。因此,对VD患者进行有效治疗成为目前神经内科临床急需关注和亟需解决的问题。干细胞具有自我增殖和多向分化潜能,用于神经内科疾病治疗,如阿尔茨海默病（Alzheimer disease, AD）、帕金森病（Parkinson disease, PD）、缺血性脑血管病、脊髓损伤及遗传变性疾病等,并取得了一定的效果,成为科学研究的热点。近年来许多研究证明人脐血（human umbilical cord blood, HUCB）中含有丰富的干细胞。其中干细胞可分为造血干细胞及间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）两种成份。HUCB中的造血干细胞应用于临床已经多年,具有良好的安全性和临床效果。HUCB-MSCs具有较强的可塑性,能发育成多种细胞,如成骨细胞、成脂肪细胞、神经细胞、肝脏细胞等,成为人MSCs的重要来源。实验证明HUCB来源的MSCs比骨髓MSCs具有更多的分化潜力。HUCB-MSCs经诱导可分化为神经细胞,用于神经系统疾病治疗取得了一定的成果。国内学者将HUCB干细胞用于VD的治疗,证明可以使动物在行为学上有所改善。单唾液酸神经节苷脂（Monosialoganglioside,GM1）广泛存在于细胞外表面,在神经系统含量丰富,对中枢神经系统有促进生长发育及损伤后保护作用。动物实验证明不同途径给予GM1均可增加老年鼠脑海马区蛋白激酶含量,提高其对神经营养因子:神经生长因子（nerve growth factor,NGF）和脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）的反应能力。为探讨HUCB-MSCs移植治疗VD的作用及GM1腹腔注射是否对该治疗具有协同作用,本文将从HUCB中分离出单个核细胞（Mononuclear cells, MNCs）,经多次传代获得MSCs,经流式细胞仪鉴定,用5-溴-脱氧尿嘧啶核苷（ 5-Bromodeoxyuridine,BrDU ）标记后移植到2-血管阻断（2-vessel occlusion, 2-VO）VD模型大鼠脑内海马CA1区,免疫组织化学方法了解移植细胞在大鼠脑内的存活、迁移情况及其对大鼠脑组织的影响;Morris水迷宫（ Morris Water Maze, MWM）比较移植前后大鼠的行为学。同时行GM1腹腔注射,了解GM1在细胞移植治疗VD时是否具有协同作用。材料和方法:1、人脐血的采集、分离、培养与纯化:脐血由第三军医大学西南医院产科提供。无菌条件下采集健康、足月产妇胎盘脐带静脉血,用肝素抗凝采血袋收集,每份脐血50～100 ml。沉淀红细胞,叠加于相对密度1.077的Ficoll人淋巴细胞分离液上,离心机2000转/分离心30min,取界面层单核细胞,洗涤两次,于DMEM+20%胎牛血清中培养,经35次传代至细胞生长成均一长梭形间充质样细胞。2、HUCB-MSCs的流式细胞仪鉴定:取培养的HUCB-MSCs洗涤后按1×105/ml个细胞加入Eppendoff管,每管50ul。分别加入鼠抗人FITC及PE抗体CD29、CD34、CD44、CD45、CD105;阴性对照管分别加入抗鼠的FITC及PE单克隆抗体;室温孵育20 min,流式细胞仪检测。3、大鼠2-VO痴呆模型的制作:选取清洁级成年Sprague-Dawley（SD）大鼠120只,3～4月龄,雌雄不拘,体质量260 g～320 g,永久结扎双侧颈总动脉制作VD模型,以Morris水迷宫鉴定手术效果。4、实验动物分组:将手术后的大鼠依次编号,以随机数法将大鼠随机分为模型组（Model Group,n=30）、细胞移植组（cell transplant group, n=30）,GM1组（GM1 injection group, n=30）和细胞移植联合GM1注射组（简称联合治疗组）（combination treatment group, n=30）。模型组及各治疗组又分为术后1天（1d）、3天（3d）、1周（1w）、2周（2w）、3周（3w）、4周（4w）各亚组,每亚组各5只大鼠。对照组（Control Group,n=5）不进行手术。5、HUCB-MSCs的BrDU标记:将传代得到的HUCB-MSCs加入终浓度为10μmol/L的BrDU共培养48 h,并行BrDU免疫荧光染色,计算标记率。6、HUCB-MSCs移植于2-VO痴呆模型大鼠脑内海马CA1区:用鼠脑立体定向仪将标记的HUCB-MSCs立体定向注射到细胞移植组和联合治疗组大鼠脑内海马CA1区。7、细胞移植效果的鉴定:①移植细胞存活情况鉴定:采用免疫组织化学染色对大鼠脑组织内的BrDU阳性细胞进行鉴定,并了解BrDU标记细胞存活及其在注射周围区迁移情况;②脑内生长相关蛋白-43（growth associated protein-43, GAP-43）阳性细胞增殖情况:采用免疫组织化学染色了解各组大鼠脑内各时间点GAP-43阳性细胞增殖情况;③大鼠行为学测定:用Morris水迷宫系统比较各组术后4w大鼠行为学。8、GM1腹腔注射:GM注射组及联合治疗组腹腔注射GM1连续14天。9、GM1联合治疗效果鉴定:鉴定指标同7。结果:1、HUCB中分离培养出MSCs:分离出的HUCB-MNCs呈小圆形,在光镜下颜色较深,并不停振动。培养及传代后长成大小均一的小长梭形细胞。经流式细胞仪检测均稳定地表达MSCs相关的抗原标记CD29、CD44、CD105,不表达造血细胞系的表面标记CD34、CD45,为HUCB中的MSCs。2、移植细胞存活情况:免疫组化染色显示BrDU标记的HUCB-MSCs在大鼠脑内可以存活,并有在血管周围聚集的趋势,随时间延长存活细胞数量逐渐减少。3、GAP-43阳性细胞增殖情况:免疫组化染色显示细胞移植后大鼠脑GAP-43阳性细胞数增多,与模型组相比有显著差异（P<0.05）。4、大鼠行为学检测:Morris水迷宫检测,VD模型大鼠移植HUCB-MSCs后,找到平台时间与模型组相比有显著差异（P<0.05）。5、GM1治疗效果:GM1注射组GAP-43阳性细胞增殖数量、大鼠行为学检测均较模型组差异显著（P<0.05）。6、GM1协同作用:联合治疗组BrDU阳性细胞存活数量在2w、3w、4w与细胞移植组有显著差异（P<0.05）。联合治疗组GAP-43阳性细胞数在术后1w和2w与细胞移植组及GM1注射组相比更多,有显著性差异（P<0.05）。结论:1、HUCB中分离的MNCs经培养、传代后可长成大小均一的小长梭形细胞,为HUCB中的MSCs。经流式细胞仪检测,表达MSCs表面抗原,具有MSCs的性质。提示脐血中存在较为原始的干细胞,可以应用于神经系统疾病的治疗。2、HUCB-MSCs标记后移植到VD模型大鼠脑内海马CA1区,能够在大鼠脑内存活并增殖,随着时间的推移,HUCB-MSCs在大鼠脑内迁移。提示HUCB-MSCs可以在大鼠脑内存活,是HUCB-MSCs治疗神经系统疾病的基础。3、细胞移植后,经Morris水迷宫检测,大鼠学习记忆能力明显恢复。证实HUCB-MSCs移植对VD大鼠的认知功能有明显改善作用。4、细胞移植后,大鼠脑内的GAP-43阳性细胞增多。证实HUCB-MSCs可促进大鼠脑内细胞增殖,突触生长,重塑大鼠脑内的细胞连接,改善大鼠脑功能。5、细胞移植同时给予GM1腹腔注射,大鼠学习记忆能力恢复、移植细胞存活数量与GAP-43阳性细胞增殖数量均增加,说明GM1在细胞移植治疗VD中有协同作用。

论文目录

• 中英文对照表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 论文正文 人脐血干细胞海马移植治疗血管性痴呆大鼠及GM1 对其影响
• 前言
• 第一部分 人脐血间充质干细胞的分离、培养与鉴定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 人脐血间充质干细胞海马移植对血管性痴呆的治疗作用
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 GM1 对人脐血间充质干细胞移植治疗血管性痴呆大鼠的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 全文结论
• 致谢
• 照片
• 参考文献
• 文献综述 脐血干细胞治疗血管性痴呆的可能性
• 参考文献
• 硕士在读期间发表的文章