烟夜蛾滞育激素基因的克隆及在粟酒裂殖酵母中的表达

论文摘要

根据GenBank发表序列（AY052417）设计引物,以烟夜蛾（Helicoverpa assulta Guenée）滞育蛹为材料,利用RT-PCR技术扩增到滞育激素（diapause hormone,DH）cDNA,并通过TA克隆的方法将其克隆至pGEM-T Easy载体上,对目的基因进行测序,并利用设计的酶切位点将目的基因从T载体上切下。目的片断和穿梭质粒pESP-2经BamHⅠ/NheⅠ双酶切,连接得到重组表达质粒pESP-DH,所得重组质粒经测序证明编码序列完整,阅读框正确。通过LiAc法将重组表达质粒pESP-DH转化入粟酒裂殖酵母菌株SP-Q01中,含有pESP-DH的SP-Q01工程菌经EMM培养基诱导表达后,SDS-PAG分析产生49kDa左右的特异蛋白质条带,而含有5μM硫胺素的EMM诱导的SP-Q01工程菌则没有相应的条带。为了进一步检测表达产物是不是含有GST标签的融合蛋白,以Anti-GST为第一抗体,以Goat Anti-mouseIgG AP为二抗,对表达产物进行Western blotting分析,结果表明,pESP-DH经EMM培养基诱导产生的49kDa蛋白条带与抗体发生很强的交叉反应,表明融合蛋白得到了表达。该融合蛋白含有一个GST标签,可以在对融合蛋白进行亲和层析的同时,结合相应的蛋白酶切割实现目的蛋白的纯化。 本实验并对烟夜蛾滞育激素基因核苷酸序列进行了生物信息学分析,预测分子重量22,343.2Da;等电点9.42;分子式为C986H1546N282O298S7;蛋白在酵母体内的半衰期大于20个小时;负电氨基酸（Asp+Glu）占13.9%,正点氨基酸（Arg+Lys）占17.7%;蛋白的不稳定指数为46.03,是不稳定蛋白。对Prosite数据库扫描,显示有4个Pyrokinins signature和8类21个蛋白修饰位点。在同源性比对过程中证实4个Pyrokinins signature在昆虫体内高度保守且其N端都有蛋白水解酶位点。通过对11种昆虫进行进化树构建,发现烟夜蛾与棉铃虫和谷实夜蛾进化距离很近。

论文目录

• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 昆虫滞育的概念
• 1.2 昆虫滞育的分类
• 1.3 昆虫滞育的环境因子
• 1.3.1 光周期
• 1.3.2 温度
• 1.3.3 食料
• 1.3.4 湿度
• 1.3.5 密度
• 1.4 滞育与休眠
• 1.5 昆虫滞育内分泌学研究
• 1.6 昆虫滞育相关的代谢机制的研究
• 1.6.1 碳水化合物的代谢
• 1.6.2 水分代谢
• 1.6.3 脂肪及脂肪酸代谢
• 1.6.4 蛋白质和氨基酸代谢
• 1.6.4.1 蛋白质代谢
• 1.6.4.2 氨基酸代谢
• 1.6.5 核酸代谢
• 1.7 昆虫滞育的分子生物学研究
• 1.7.1 滞育激素的分离和纯化
• 1.7.2 滞育激素的结构和功能
• 1.7.3 滞育激素基因的克隆、结构特征和表达
• 1.7.5 滞育激素基因的定位
• 1.7.6 滞育相关酶的研究
• 1.7.6.1 滞育激素调控代谢过程中的关键酶—海藻糖酶的研究
• 1.7.6.2 滞育解除过程中的关键酶—山梨醇脱氢酶的研究
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 供试昆虫
• 3.1.2 供试菌种及质粒
• 3.1.3 供试酶类、抗体与Marker
• 3.1.4 供试试剂盒
• 3.1.5 缓冲溶液
• 3.1.6 转化酵母与表达的试剂
• 3.1.7 培养基储存液及培养基
• 3.1.7.1 培养基储存液
• 3.1.7.2 培养基
• 3.1.8 SDS—PAGE电泳
• 3.1.8.1 SDS—PAGE电泳液的配制
• 3.1.8.2 SDS—PAGE电泳凝胶的灌制
• 3.1.9 Western blotting所用溶液
• 3.1.10 其它溶液
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 总RNA的提取
• 3.2.2 琼脂糖凝胶电泳
• 3.2.3 RT-PCR
• 3.2.3.1 引物设计
• 3.2.3.2 cDNA第一链的合成
• 3.2.3.3 PCR扩增
• 3.2.3.4 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测
• 3.2.4 PCR产物纯化
• 3.2.5 质粒的连接
• 3.2.6 DH5α感受态细胞的制备和质粒的转化
• 3.2.6.1 DH5α感受态细胞的制备（CaCl2法）
• 3.2.6.2 重组克隆质粒的转化
• 3.2.7 阳性克隆的筛选
• 3.2.8 重组克隆质粒DNA的提取
• 3.2.9 重组克隆质粒的鉴定
• 3.2.9.1 重组克隆质粒双酶切鉴定
• 3.2.9.2 重组克隆质粒的PCR鉴定
• 3.2.10 序列测定
• 3.2.11 生物信息学分析
• 3.2.12 重组表达质粒的构建
• 3.2.12.1 重组克隆质粒与表达质粒的双酶切
• 3.2.12.2 目的片段的回收纯化
• 3.2.12.3 目的片段和表达载体片段的连接
• 3.2.12.4 DH5α感受态细胞的制备
• 3.2.12.5 连接产物转化DH5α感受态细胞
• 3.2.12.6 pESP-DH重组质粒的抽提
• 3.2.12.7 pESP-DH重组质粒的鉴定
• 3.2.13 pESP-DH重组质粒的序列测定
• 3.2.14 重组表达酵母的获得与鉴定
• 3.2.14.1 裂殖酵母感受态细胞的制备
• 3.2.14.2 pESP-DH重组质粒的转化
• 3.2.14.3 制备酵母甘油母株
• 3.2.14.4 重组表达酵母PCR鉴定
• 3.2.15 重组表达酵母的小量诱导表达
• 3.2.15.1 酵母细胞培养的准备
• 3.2.15.2 小规模诱导表达GST-DH融合蛋白
• 3.2.16 诱导表达的GST-DH融合蛋白检测与分析
• 3.2.16.1 融合蛋白的预处理
• 3.2.16.2 SDS-PAGE检测
• 3.2.16.3 Western blotting分析
• 4 结果与分析
• 4.1 RT-PCR扩增结果
• 4.2 重组克隆质粒的鉴定
• 4.2.1 重组质粒双酶切鉴定
• 4.3 DH基因序列测定
• 4.4 DH基因的生物信息学分析
• 4.5 pESP-DH重组表达质粒的鉴定
• 4.5.1 重组表达质粒的PCR鉴定
• 4.5.2 重组表达质粒双酶切鉴定
• 4.6 重组表达酵母PCR鉴定
• 4.7 酵母表达产物的SDS-PAG分析
• 4.8 酵母表达产物的Western blotting分析
• 5 结论与讨论
• 5.1 结论
• 5.2 讨论
• 参考文献
• 英文摘要