论文摘要
本文概述了民间药用植物乌蕨（Stenoloma chusanum （Linn.）Ching）的形态特征和资源分布情况,综述了国内外对乌蕨的药理药效作用、化学成分的研究进展,并对乌蕨所含有的几种主要化学成分的生物活性进行了总结。作者提出应当对乌蕨生物活性的物质基础进行深入研究,还应对其引种、繁殖及栽培技术进行研究,为开发利用这一植物资源建立基础。作者的主要研究结果有以下几个方面：1.乌蕨的化学成分研究利用硅胶、聚酰胺、Lichroprep RP-18. Sephadex LH20等层析材料,对乌蕨的乙醇提取物进行分离,根据化合物的理化性质、波谱数据（ESI-MS、HR-MS、1H-NMR.13C-NMR、DEPT、HSQC、HMBC）、标准品对照并参考文献资料,对分离得到的化合物进行了结构鉴定,已分离并鉴定了19个化合物,它们分别为：乌蕨苷A（stenolomaside A）即[3-（9,3’,5’-三甲氧基-4’-羟基-亚苄基）色满-4-酮]-5-O-β-D-葡萄糖苷[3-（9,3’,5’-trimethoxy-4’-hydroxy-benzylidene） chroman-4-one]-5-O-β-D-glucoside,该化合物晶体同时存在反式（1a）和顺式（1b）两种化学结构,乌蕨素1（stenolin1）即香草酸-4-O-β-D-（6-O-龙胆酰基）-吡喃葡萄糖苷（4-O-β-D-（6-O-gentisoylglucopyranosyl） vanillic acid）（2）,乌蕨素2（stenolin2）1即龙胆酸-2-O-β-D-（6-O-龙胆酰基）-吡喃葡萄糖苷（2-O-β-D-（6-O-gentisoyl glucopyranosyl）gentisic acid）（3）,荭草苷（Orientin）（4）,荭草苷-2"-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（Orientin-2"-O-β-D-glucopyranoside）（5）,牡荆素（Vitexin）（6）,芹菜素（Apigenin）（7）,牡荆素鼠李糖苷（Vitexin rhamnoside）（8）,牡荆素吡喃葡萄糖苷（vitexin glucopyranoside）（9）,香草酸（Vanillic acid）（10）,丁香酸（Syringic acid）（11）,龙胆酸（Vanillic acid）（12）,原儿茶醛（protocatechualdehyde）（13）,6,7-二羟基香豆素（6,7-dihydroxycoumarin）（14）,十五烷醇（pentadecanol）（15）,十六烷酸（hexadecanoic acid）（16）, β-谷甾醇（β-sitosterol）（17）,胡萝卜苷（daucosterol）（18）。其中化合物（1a）、（1b）、（2）和（3）为新化合物,化合物（4）、（5）、（8）、（9）、（10）、（14）、（15）和（16）为首次从该植物中分离得到的化合物。2-乌蕨主要成分的定量分析及其资源评价作者建立了乌蕨地上部分荭草苷和牡荆素含量的测定方法,检测不同产地乌蕨中两种黄酮苷的含量,据此对乌蕨资源进行了评价。用超声波提取法提取,RP-HPLC测定,Gemini C18色谱柱,乙腈-1%磷酸溶液（V：V=15：85）为流动相,流速1mL/min,检测波长340nm。荭草苷在0.025～0.148μg范围内有良好的线性关系,加样回收率为100.61%,相对标准偏差（RSD）2.18%；牡荆素在0.035～0.207μg范围内有良好的线性关系,加样回收率为99.77%,RSD2.37%。精密度试验测得荭草苷峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.10%,牡荆素峰面积的RSD为0.17%。重复性试验测得荭草苷和牡荆素峰面积的RSD分别为1.10%和0.49%。稳定性试验表明样品在6h内稳定。从HPLC图谱可见,荭草苷和牡荆素为乌蕨中二种主要的黄酮类化合物。在所测定的乌蕨种源中,牡荆素含量均高于荭草苷含量,但两者的比例不是固定不变的,云南丘北所产乌蕨的荭草苷和牡荆素含量都是最高,分别达到1.166和1.457mg/g,移栽到南京地区1年后荭草苷含量下降,牡荆素含量增高。结果表明,以荭草苷和牡荆素含量为指标,云南丘北所产乌蕨是较好的种源。用超声提取法提取不同产地乌蕨地上部分的总黄酮,以芦丁为对照品,建立标准曲线,采用NaNO2-Al（NO）3-NaOH比色法测定总黄酮含量。结果表明,云南丘北所产乌蕨总酮含量最高,达127.461mg·g-1,移栽到南京地区2年后仍保持较高水平；用孢子培育的植株总黄酮含量高达187.038mg·g-1；同一产地的乌蕨,叶片总黄酮含量显著高于叶柄。分析结果表明,以总黄酮含量为指标,云南丘北所产乌蕨是较好的种源,采集乌蕨药材应以叶片为主,通过人工栽培开发利用乌蕨资源是可行的。3.乌蕨中荭草苷和牡荆素提取纯化方法为了简便、安全、经济、有效地从乌蕨中得到单体化合物荭草苷和牡荆素,建立了一种从乌蕨的地上部分提取纯化荭草苷和牡荆素的方法,其特征是先从乌蕨地上部分获得粗黄酮析出物,再将粗黄酮用碱水助溶,稀释后用酸中和,经过反相硅胶柱层析,得到目标产物荭草苷和牡荆素,纯度达98%以上。4.乌蕨中新化合物的生物活性研究a.酚性化合物的抗真菌试验用琼脂稀释法（试管法）测定了新化合物乌蕨素1、乌蕨素2及已知化合物香草酸、丁香酸和龙胆酸的抗真茵活性,检测菌株分别为白念珠菌Candida albicans,新生隐球菌Cryptococcus neoformans,红色毛癣茵Trichophyton rubrum,须癣毛癣菌Trichophyton mentagrophytes,犬小孢子菌Microsporum canis,絮状表皮癣菌Epidermophyton floccosum和黑曲霉Aspergillus niger。乌蕨素1、乌蕨素2、香草酸、丁香酸和龙胆酸对所检测真菌的最小抑制浓度（MIC）为25-100u g·ml-1,乌蕨素1和乌蕨素2的抗真菌活性分别低于它们糖苷化前的简单酚性酸即香草酸和龙胆酸。b.黄酮类化合物对人肿瘤细胞的体外生长抑制作用乌蕨苷A是从乌蕨中分离得到的新化合物,具有高异黄酮的化学结构,荭草苷和牡荆素是乌蕨中得量较多的两种黄酮苷,用MTT法测定了乌蕨苷A、荭草苷和牡荆素在四种浓度（10-4mol/L,10-5mol/L,10-6mol/L和10-7mol/L）下对5种肿瘤细胞体外生长的抑制作用。结果表明,在高浓度（10-4mol/L）时,3种黄酮类化合物对5种肿瘤细胞的抑制作用均较小或无效,抑制百分率最大值在20%左右。对于人白血病细胞HL-60,乌蕨苷A的抑制百分率为18.22%,荭草苷的抑制百分率为13.29%,牡荆素则无效。对于人白血病细胞K562,荭草苷和牡荆素的抑制百分率分别为19.29%和21.2%,乌蕨苷A的抑制百分率为9.21%。牡荆素对人肺癌细胞A549的抑制百分率为18.99%,其余样品均无效。3种黄酮类化合物对人肝癌细胞HepG2和人肝癌细胞SMMC-7721的生长基本无抑制作用。5.乌蕨孢子萌发、配子体世代形态变化及孢子繁殖技术的研究研究了外界条件对乌蕨孢子萌发的影响。用随机区组试验和方差分析探讨培养温度、贮藏温度、GA处理、光照强度对乌蕨孢子萌发的影响。与室温（20～25℃）相比,28℃培养的孢子最大萌发率相近而萌发速率显著较高；贮藏温度（A）极显著（P<0.01）影响孢子萌发率,-20℃贮藏降低萌发率；GA（B）对孢子萌发率无显著影响；光照强度（C）极显著（P<0.01）影响孢子萌发率,充足光照和弱光照无显著差异,黑暗处理降低萌发率；A×B,A×C,BxC及A×BxC交互效应不显著。采用电镜、光学显微镜及解剖镜观察乌蕨从孢子到孢子叶形成阶段的形态变化,观察温度和光强对配子体生长发育的影响,确定乌蕨孢子繁殖的适宜条件。乌蕨孢子呈肾形,极轴长（48～54）51μm,赤道轴长（31～37）34μm,外壁光滑或具微小疣状纹饰。播孢后6d孢子开始萌发,细胞分裂成为丝状体,随后又分裂成心形的原叶体,播孢后45d原叶体腹面凹口下方产生精子器,播孢后55d又在腹面凹口生长点下方产生颈卵器。颈卵器形成后继续培养12d可形成幼小的孢子体。乌蕨孢子在温度23℃左右,光照强度10000Lx,培养基质为泥炭土：田园土：河沙=2：1：1,含水量处于饱和状态时能正常生长发育,形成孢子体。