MATSA的分离纯化及其单克隆抗体的研制

论文题目: MATSA的分离纯化及其单克隆抗体的研制

论文类型: 博士论文

论文专业: 临床兽医学

作者: 穆杨

导师: 张彦明

关键词: 细胞,马立克病肿瘤相关表面抗原,分离,纯化,单克隆抗体

文献来源: 西北农林科技大学

发表年度: 2005

论文摘要: 马立克病(Marek’s disease,MD)是由疱疹病毒科(Herpesviridae)的马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)引起的鸡的一种传染性肿瘤病,以淋巴组织增生和肿瘤形成为特征,在外周神经、性腺、虹膜、各种脏器、肌肉和皮肤发生单核细胞浸润。MD不但引起鸡的肿瘤,还损害感染鸡的免疫器官,造成免疫抑制状态,导致机体抵抗力下降和对接种疫苗的免疫应答降低或不应答,引发其他多种疾病的并发和继发感染,造成巨大的经济损失。通过接种致弱的MDV、非致病性的MDV或火鸡疱疹病毒可以预防MD。MD是世界上第一个用疫苗来预防病毒性肿瘤病获得成功的范例,对该病的研究不仅有助于促进养禽业的发展,而且可为探索病毒致病机制、预防和控制人类和动物肿瘤性疾病提供理想的模型。 MDV感染后3～5周,在鸡体内形成T细胞淋巴瘤,由形成的淋巴瘤可以建立MD成淋巴细胞系,马立克病肿瘤相关表面抗原(Marek’s disease tumor-associated surfaceantigen,MATSA)是MD肿瘤细胞和MD成淋巴细胞系细胞表面存在的特异性抗原,是细胞转化的标志。 以单克隆抗体为载体的抗肿瘤导向药物既是医药生物技术领域的研究热点,也是抗肿瘤药物研究的重大课题。本研究就MATSA的分离纯化及其单克隆抗体的研制进行了研究。 1.将液氮中冻存的MDV GA株复苏后,接种9日龄无特定病原体(Specific pathogenfree,SPF)鸡胚成纤维细胞进行复壮,然后用复壮后的MDV GA株感染1日龄雏鸡,从35日龄开始有发病死亡的,典型的内脏型病例剖检可见肝脏、脾脏肿大,其上形成大小不等的肿瘤结节,色灰白,质地坚硬且致密,有些病例的肿瘤呈弥散性生长,整个器官肿大明显,色泽灰白的肿瘤组织与原有组织的色彩相间存在,器官横切面呈大理石花纹状;内脏肿瘤形成率35%(14/40)。 2.将采集的MD病鸡的肝脏和脾脏等肿瘤组织除去筋膜组织后用PBS冲洗几次,剪成1mm~3的小块,用PBS冲洗至无血色,在均质机上匀浆后用PBS洗3次,按1∶20的比例将细胞悬浮于冷的柠檬酸缓冲液中,4℃作用25min;离心,细胞沉淀用PBS悬浮,加入木瓜蛋白酶和L-胱氨酸溶液分离肿瘤细胞表面的MATSA。对木瓜蛋白酶处理前后的肿瘤细胞进行间接荧光抗体染色表明,MATSA被从肿瘤细胞表面去除下来了。间接ELISA表明,提取的液体里面含有目的蛋白MATSA。 3.用DMEM加上胎牛血清培养MSB1细胞,将培养收获的MSB1细胞用磷酸盐缓冲液洗涤3次,除去其中的血清,然后按每2×10~6个细胞加入2IU木瓜蛋白酶和1mmol/L的L-胱氨酸溶液0.1mL,混匀后37℃作用1h,以分离MSB1细胞表面的MATSA,对木瓜蛋白酶处理前后的MSB1细胞进行间接荧光抗体染色以检测MATSA的分离情况。

论文目录:

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文献综述

第一章 MD的研究进展

1.1 历史

1.2 病原研究

1.2.1 MDV的分类地位

1.2.2 MDV的血清型

1.2 3 MDV的形态结构

1.2.4 理化特性

1.3 流行病学

1.3.1 易感动物

1.3.2 传染源与传播途径

1.4 MD的临床症状及病理变化

1.4.1 临床症状

1.4.2 剖检病变

1.5 MD的发病机理

1.5.1 生产性-限制性感染

1.5.2 潜伏感染

1.5.3 后期溶细胞性感染

1.5.4 转化感染

1.6 MD的诊断

1.6.1 病毒分离

1.6.2 病毒的鉴定

1.6.3 血清学诊断

1.6.4 分子生物学诊断技术

1.7 MD的治疗和防制

1.7.1 治疗

1.7.2 预防

第二章 MDV分子生物学研究进展

2.1 MDV的基因组

2.2 MDV编码的蛋白

2.2.1 病毒编码的酶类

2.2.2 病毒编码的抗原

2.2.3 病毒编码的其他蛋白

2.3 MDV致肿瘤基因的研究

2.3.1 meq基因

2.3.2 132bp重复序列

2.3.3 pp38基因

第三章 MD感染与肿瘤发生的免疫学研究

3.1 MDV的感染

3.2 MD淋巴瘤的发生

3.2.1 MD淋巴瘤发生的靶细胞研究

3.2.2 影响 MDV感染中细胞转化的因素

3.3 MD肿瘤发生的研究

3.3.1 免疫监视的逃避

3.3.2 抗原特异性缺乏

3.3.3 免疫抑制

3.4 MDV致瘤机制的研究

3.5 MD疫苗抗肿瘤作用的研究

第四章 马立克病肿瘤相关表面抗原的研究进展

4.1 MATSA的分布

4.2 MATSA的分离和纯化

4.3 MATSA的理化特性

4.4 MATSA的抗体

实验研究

第五章 MD肿瘤细胞表面 MATSA的提取与鉴定

5.1 材料

5.1.1 试验动物

5.1.2 毒株

5.1.3 MSB1细胞

5.1.4 主要试剂

5.1.5 主要仪器设备

5.2 方法

5.2.1 CEF的制备

5.2.2 MDV复壮

5.2.3 雏鸡人工感染

5.2.4 MD肿瘤组织的采取

5.2.5 MATSA的提取

5.2.6 Brodard微量法测定蛋白浓度

5.2.7 抗MATSA 兔血清制备

5.2.8 MATSA的鉴定

5.3 结果

5.3.1 MDV复壮

5.3.2 雏鸡人工感染

5.3.3 蛋白质浓度测定

5.3.4 微量凝集试验结果

5.3.5 悬浮细胞 ELISA结果

5.3.6 MATSA的鉴定

5.4 讨论

5.5 小结

第六章 MSB1细胞表面 MATSA的分离鉴定与纯化

6.1 材料

6.1.1 MSB1细胞

6.1.2 主要试验

6.1.3 主要仪器设备

6.2 方法

6.2.1 MSB1细胞的培养

6.2.2 MATSA的提取

6.2.3 MATSA的鉴定

6.2.4 MATSA蛋白浓度测定

6.2.5 MATSA的纯化

6.2.6 收集峰的蛋白质 SDS-PAGE分析

6.3 结果

6.3.1 MSB1的培养

6.3.2 MATSA的鉴定

6.3.3 粗提的 MATSA蛋白浓度测定

6.3.4 MATSA的纯化

6.3.5 收集峰蛋白质的 SDS-PAGE分析

6.4 讨论

6.4 小结

第七章 MATSA抗体间接 ELISA检测方法条件的筛选

7.1 材料

7.1.1 主要试剂

7.1.2 主要器材

7.1.3 实验动物

7.2 方法

7.2.1 抗原准备

7.2.2 抗体准备

7.2.3 间接 ELISA条件的筛选

7.2.4 MATSA间接 ELISA操作步骤

7.3 结果

7.3.1 包被条件的确定

7.3.2 封闭条件的确定

7.3.3 抗原最佳包被浓度的确定

7.3.4 抗原包被酶标板保存期

7.3.5 血清稀释度的确定

7.3.6 酶标二抗作用时间的确定

7.3.7 酶标二抗稀释度的确定

7.3.8 底物作用时间的确定

7.3.9 终止液浓度的确定

7.3.10 洗涤方式的确定

7.4 讨论

7.4.1 固相载体

7.4.2 包被

7.4.3 封闭

7.4.4 抗原包被浓度

7.4.5 血清稀释度

7.4.6 酶标抗体的稀释度

7.4.7 洗涤

7.5 小结

第八章 MATSA单克隆抗体的研制

8.1 材料

8.1.1 主要试剂

8.1.2 培养基及主要溶液

8.1.3 骨髓瘤细胞

8.1.4 试验动物

8.1.5 主要器材

8.2 方法

8.2.1 小鼠免疫

8.2.2 饲养细胞的制备

8.2.3 骨髓瘤细胞的制备

8.2.4 脾细胞制备

8.2.5 细胞融合及培养观察

8.2.6 阳性杂交瘤细胞的筛选

8.2.7 阳性孔杂交瘤细胞克隆化

8.2.8 克隆化阳性孔的单克隆培养

8.2.9 细胞的冻存

8.2.10 抗体分泌稳定性检测

8.2.11 腹水的制备

8.2.12 单克隆抗体效价测定

8.2.13 单克隆抗体相对亲和力测定

8.3 结果与分析

8.3.1 免疫小鼠的抗体测定结果

8.3.2 细胞融合及培养观察

8.3.3 阳性杂交瘤细胞的筛选、克隆

8.3.4 杂交瘤细胞抗体分泌稳定性检测结果

8.3.5 MATSA单克隆抗体效价测定结果

8.3.6 单克隆抗体相对亲和力测定

8.4 讨论

8.4.1 单克隆抗体的优点

8.4.2 抗原性质对单克隆抗体制备的影响

8.4.3 免疫程序对单克隆抗体制备的影响

8.4.4 关于单克隆抗体制备中的检测方法

8.4.5 单克隆抗体的亲和力测定

8.5 小结

结论

致谢

参考文献

作者简介

发布时间: 2007-04-06

参考文献

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