斑马鱼肌肉发育相关基因的克隆、表达与功能分析

论文摘要

本文主要研究在斑马鱼胚胎发育过程中参与肌肉发育的相关基因,克隆了四个在体节和肌肉中表达的基因全长,分析了基因的时空表达特征,并对其中两个基因进行了过表达,分析其在体节形成和肌肉发生过程中的功能。从斑马鱼中克隆到甲状腺激素受体相关蛋白基因TRAP150。原位杂交分析TRAP150表达在近轴细胞的慢肌和体节的快肌,表达模式与MyoD的模式相近;并表现出肌肉特异性表达,TRAP150在体节形成和肌肉发生早期高水平说明TRAP150在肌肉分化过程发挥着重要的作用。此外,在胚胎的心脏中也检测到TRAP150的表达。在斑马鱼胚胎过量表达TRAP150造成MyoD在近轴中胚层的过量表达,而对MyoD在近轴细胞的表达影响不明显;由于MyoD在近轴中胚层的表达将诱导快肌的形成,因此过量表达TRAP150将可能导致快肌的增多;从过量表达的结果分析,TRAP150在MyoD的上游正向调控MyoD的表达,是诱导快肌的分化的重要基因。从斑马鱼中克隆到双特性酪氨酸调控激酶新基因DYRK2。RT-PCR结果表明DYRK2具有母源性表达的特点,并且在36小时前各个时期都有表达。DYRK2在体节形成后表达在体节的近轴细胞中,大约在15个体节时检测到在快肌部位表达,18小时后在胚胎肌肉组织、脑部以及眼睛表达。DYRK2在斑马鱼胚胎发育过程中与体节和肌肉发生相关的基因之一,并可能参与脑和眼睛的发生。在斑马鱼胚胎中过量表达DYRK2导致肌肉标记基因MyoD的表达出现了很大的变化,注射侧MyoD在近轴细胞和近轴中胚层过量表达,尤其是在未形成体节的体节前体中胚层,注射侧的MyoD有大范围的高表达,而在正常一侧没有表达。MyoD的过量表达说明斑马鱼胚胎早期DYRK2通过调控MyoD的表达影响慢肌的分化。克隆得到斑马鱼的血细胞生成的PBX1互作蛋白基因HPIP1。RT-PCR结果表明HPIP1在斑马鱼胚胎表达具有母源性,但是原位杂交的检测一直到10个体节时才检测到,说明HPIP1一直到肌肉分化后才大量表达,可能在肌肉的成熟阶段起作用。当胚胎发育到18小时,HPIP1表达在所有体节中,前端的较早形成的体节中表达量比晚形成的体节表达量高,也符合HPIP1参与肌肉成熟过程的判断。HPIP1还表达在胚胎的眼部周围,说明HPIP1可能参与到眼部肌肉的形成。在斑马鱼中克隆的Chp-1相似蛋白基因CHORDC1。在3个体节时,CHORDC1表达在脊索两侧的近轴细胞中,而在5个体节时CHORDC1在表达在体节中,这个特点与MyoD的表达很相似,与MyoD在体节中表达不同的是,CHORDC1也在体节前体中胚层中表达,这与Myf5的表达特点相似,CHORDC1紧随着MyoD,Myf5的高表达说明CHORDC1在肌肉细胞的分化的早期即参与肌肉的发育,而其高表达量也说明CHORDC1在这个过程中可能起到非常重要的作用。CHORDC1在近轴中胚层的表达与MyoD,Myf5有不同的特点,这种不同表现在其在近轴中胚层的表达不仅仅限于快肌和慢肌,而且由后到前的逐渐扩展。而且,CHORDC1在心肌中也表达说明其不仅在骨骼肌中发挥作用。综合CHORDC1的表达特点可以认为其对肌肉的作用不限于特定肌肉类型,广泛参与到各种肌肉的发育过程。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1. 胚胎肌肉发育
• 1.1 动物的肌肉发育
• 1.2 鱼类的肌肉发育
• 1.3 骨骼肌发育的特化信号
• 1.4 肌肉调节因子（MRFs）在肌肉发育中的功能
• 1.5 肌肉调节因子的调控
• 2. 甲状腺激素对肌肉分化的调控及甲状腺激素受体复合物的结构与功能
• 2.1 通过甲状腺激素对脊椎动物肌肉分化的调控：MyoD 基因家族的作用
• 2.2 甲状腺激素受体相关蛋白TRAP 的结构与功能
• 3. 双特性酪氨酸调控激酶DYRK 的研究进展
• 4.P BX 及其互作蛋白HPIP 的结构与功能
• 5. 锌指蛋白研究进展及CHORD-containing 蛋白的结构与功能
• 6. 模式生物斑马鱼及其在基因功能中的研究
• 7. 研究意义
• 第二章 斑马鱼甲状腺激素受体相关蛋白TRAP150 克隆、表达与功能分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 斑马鱼的培育与实验材料的获得
• 1.2 实验试剂
• 1.3 质粒与菌株
• 1.4 仪器
• 1.5 计算机程序
• 1.6 引物
• 1.7 实验方法
• 2. 实验结果
• 2.1 斑马鱼TRAP150cDNA 的克隆
• 2.2 斑马鱼TRAP150 的RT-PCR 分析
• 2.3 斑马鱼TRAP150 的原位杂交分析
• 2.4 斑马鱼TRAP150 的过表达分析
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 第三章 斑马鱼双特性酪氨酸调控激酶DYRK2 基因克隆、表达与功能分析
• 1. 材料与方法
• 2. 实验结果
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 第四章 斑马鱼前B 细胞白血病转录因子互作蛋白基因HPIP1 的克隆与表达
• 1. 材料与方法
• 2. 实验结果
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 第五章 斑马鱼 CHORDC1 基因的克隆与表达
• 1. 材料与方法
• 2. 实验结果
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表文章
• 致谢