海藻希瓦氏菌发酵产生河豚毒素的提取与检测

论文摘要

近年来,河豚毒素的微生物起源越来越得到人们的认可。海洋微生物发酵法产生河豚毒素,具有原料来源广、成本低,不受季节和原料的限制,不破坏生态平衡的特点,因此人们期望通过细菌发酵实现资源的有效利用和河豚毒素的大量生产。国外早在上世纪80年代就已经着手此项研究,并且取得了骄人的成绩。而我国在这方面的研究还很薄弱。海藻希瓦氏菌最早于1985年由Yuichi Kotati等人从红藻（Jania sp.）表面分离出来,当时被命名为OK-1T（T=type strain）,研究发现OK-1T与腐败希瓦氏菌有很多相似的生理、生化特征,而且可以产生河豚毒素。本论文目的在于从结构和生物学功能上证实,海藻希瓦氏菌发酵产生的TTX与河豚组织中的TTX是一致的,为TTX微生物起源假说奠定坚实的实验基础。优化海藻希瓦氏菌生产河豚毒素的发酵条件,细致研究海藻希瓦氏菌产生河豚毒素的分离纯化工作,为可持续生产TTX提供新思路。本文对海藻希瓦氏菌生理生化指标进行了测定。通过测定菌体密度和菌体收获量,研究了部分初始条件及添加不同营养物质对海藻希瓦氏菌生长的影响,采用单因素试验和正交试验对海藻希瓦氏菌生产河豚毒素的发酵条件进行了优化。优化后的培养基最佳配方为:在2216E培养基中添加1.0%葡萄糖、2.5%酵母粉、1.0%磷酸高铁。统计分析,葡萄糖是影响海藻希瓦氏菌菌体收获量的主要因素。采用SCM杯式超滤系统对海藻希瓦氏菌发酵液的过滤除杂进行了研究,考察了操作压力对过滤效果的影响,同时还针对料液的预处理对超滤结果的影响进行了研究,主要措施是调节料液pH值,改变其温度,在其中添加混凝剂。结果表明,操作压力为0.2MP,通量达到最大,截留率也相对较大。料液的pH调至4,加热料液的温度至60℃都能使通量和截留率达到较满意的水平。研究发现在料液中添加50mg/L硫酸铝混凝剂能有效减缓超滤膜污染。本文还考查了分子筛去除分子量较小的杂质的效果,其中蛋白去除率50.8%,有机物去除率82.8%。考查了弱酸性阳离子交换树脂D152对TTX的净化作用,结果显示,除色效果很好,糖类、氨基酸类也有很好的去除效果。本文利用薄层层析对发酵产物经分离得到的TTX进行初步定量,结果与小鼠生物检测法结果有良好的相关性。采用直接竞争抑制性酶联免疫吸附试剂盒对发酵产物进行了进一步的定量测定,并最终运用高效液相色谱法对海藻希瓦氏菌发酵产物中的TTX含量进行精确定性、定量。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩写中文对照
• 第一章 文献综述
• 摘要
• 0 引言
• 1 河豚毒素的毒性机理与应用价值
• 1.1 河豚毒素的毒性机理
• 1.2 河豚毒素的应用价值
• 2 河豚毒素在生物界的分布和起源
• 2.1 河豚毒素在生物界的分布
• 2.2 产生河豚毒素的细菌
• 2.3 河豚毒素的微生物起源
• 3 应用生物技术生产河豚毒素的现状与前景展望
• 3.1 现状
• 3.2 前景展望
• 第二章 海藻希瓦氏菌（Shewanella alga）的生理生化指标测定
• 摘要
• 0 引言
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 第三章 海藻希瓦氏菌（Shewanella alga）发酵培养基条件优化的研究
• 摘要
• 0 引言
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 培养基pH值对海藻希瓦氏菌生长的影响
• 2.2 在2216E培养基中添加不同碳源对海藻希瓦氏菌生长的影响
• 2.3 在2216E培养基中添加不同氮源对海藻希瓦氏菌生长的影响
• 2.4 正交试验中液体培养基体积的确定
• 2.5 优化培养基的确定
• 3 讨论
• 第四章 海藻希瓦氏菌发酵液中河豚毒素的分离与纯化
• 1 超滤在海藻希瓦氏菌发酵液后期处理中的研究
• 摘要
• 引言
• 1.1 材料与方法
• 1.2 试验结果与分析
• 1.3 讨论
• 2 分子筛层析分离河豚毒素条件的优化
• 摘要
• 引言
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 3 离子交换法从发酵液中提取TTX
• 摘要
• 引言
• 3.1 材料与方法
• 3.2 实验结果
• 3.3 讨论
• 第五章 海藻希瓦氏菌发酵液中河豚毒素的检测
• 1 酶联免疫法检测海藻希瓦氏菌发酵产物中河豚毒素的含量
• 摘要
• 引言
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果与分析
• 1.3 讨论
• 2 薄层色谱法定量检测河豚毒素（TTX）的研究
• 摘要
• 引言
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果与分析
• 2.3 讨论
• 3 高效液相色谱法检测海藻希瓦氏菌发酵产生的河豚毒素
• 摘要
• 引言
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 已发文章