棉花胞质雄性不育系与保持系线粒体基因组差异研究

论文摘要

棉花细胞质雄性不育（CMS）是母性遗传性状,在杂交棉制种中有重要的应用价值。通过不育系、保持系和恢复系的“三系”配套,以及“三系法”制种,可实现杂交棉种子规模化生产。目前,国内外已育成哈克尼西棉、三裂棉、陆地棉、海岛棉等胞质的不育系,并实现三系配套,其中陆地棉胞质不育系P30A（来源于104-7A）为核心的三系配套已应用于生产实践。导致植物细胞质雄性不育的基因被认为是位于线粒体基因组上,但是关于棉花CMS相关基因的研究报道很少。本文以P30A及其保持系P30B、恢复系Y18R为主要实验材料,对其线粒体基因组进行了Southern blot分析,克隆了不育胞质和可育胞质之间的差异序列,获得了胞质特异的RFLP、SCAR、SSR分子标记,并对差异序列进行了表达分析,为进一步克隆不育基因奠定了基础。本研究通过同源克隆的方法,获得了棉花31个线粒体基因的保守序列,从中选取20个基因做探针对不育系P30A、保持系P30B、恢复系Y18R的线粒体基因组（mtDNA）进行Southern blot分析,发现atpA、atp9、ccmB、nad1bc、nad6、nad7c、rrn18等7个基因在不育胞质和可育胞质间存在RFLP多态性。其中atpA基因的差异最明显,它在可育胞质和不育胞质中的两个RFLP片段均不相同。利用反向PCR（IPCR）方法,克隆到了可育胞质和不育胞质中atpA基因的所有EcoRI限制片段。在此基础上,应用TAIL-PCR方法,获得了可育胞质和不育胞质中atpA基因的所有HindIII限制片段。在可育胞质中,EcoRI限制片段长度分别是2225 bp和5083 bp,HindIII限制片段的长度分别是11689 bp和8501 bp;不育胞质中,EcoRI限制片段长度分别是2194 bp和3297 bp,HindIII限制片段的长度分别是11658 bp和9139 bp。序列分析发现,棉花atpA基因在可育胞质和不育胞质中各有两个拷贝:一个完整拷贝和一个3’截短型拷贝。完整atpA基因全长1524 bp;而可育胞质和不育胞质中的截短型atpA编码序列分别在1352 bp和1336 bp处截断。在完整atpA拷贝RFLP片段的3’端,即atpA基因下游第161-212 bp处,可育胞质（P30B）和不育胞质（P30A）存在差异,是一个SSR位点,该位点在P30B可育胞质中是（TAA）7（TA）6,在哈克尼西棉CMS系（CMS-D2）、P30A、晋A、湘远A不育胞质中是（TAA）3（TA）2,而在三裂棉CMS系（CMS-D8）胞质中是（TAA）4（TA）3,我们将其开发成SSR标记:SSR160。在atpA截短型拷贝RFLP片段上,即atpA编码序列截断位点（“断点”）后,可育胞质和不育胞质中分别存在一段515 bp（“N515”）和555 bp（“S555”）的差异序列,这两条差异序列完全不同,我们将其开发成SCAR515和SCAR555标记。这三个标记可用于鉴定棉花可育胞质和不育胞质。根据以上结果,对国内外的几种不同CMS系棉花的mtDNA进行了RFLP分析和差异片段的序列分析,发现在atpA基因位点,CMS-D2、P30A、晋A、湘远A这四种CMS系的RFLP图谱相同,而CMS-D8与CMS-D2、P30A、晋A、湘远A、P30B都不同。通过TAIL-PCR方法,克隆到了CMS-D8的差异EcoRI限制片段（4540 bp）,发现其中的序列与P30A相比存在5处SNP位点,根据SNP位点,开发出CMS-D8特异分子标记:SCARD8,该标记可将CMS-D8与其他CMS系进行区分。应用RT-PCR方法对atpA进行表达分析,发现棉花可育胞质和不育胞质中全长atpA基因和截短型atpA基因均转录。分析atpA基因的RNA编辑情况时发现,棉花atpA基因全长拷贝（1524bp）中存在6处RNA编辑位点,且不育胞质与可育胞质的RNA编辑率基本相同;在截短型拷贝中存在4处RNA编辑位点,不育胞质的RNA编辑率明显高于可育胞质,说明不育胞质截短型拷贝可能仍承受较高选择压,很可能具有新功能。同时,利用环化RT-PCR （cRT-PCR）法克隆到不育胞质atpA全长拷贝和截短型拷贝的转录本全长,发现atpA全长拷贝转录本中包含完整SSR160位点;atpA截短型拷贝转录本中包含完整“S555”序列。在atpA基因3’侧翼区,存在一些短重复序列,这些序列来自于nad6基因3’部分编码序列。在不育胞质中,这些短重复序列位于关键的“断点”位置,推测其在不育胞质线粒体基因组重排中发挥重要的介导作用。根据短重复序列在两种胞质中的位置和拷贝数不同开发出一个SCAR标记:SCARN6,可用于鉴别棉花可育胞质和不育胞质。Northern blot分析显示,nad6基因在棉花“三系”及F1代中都只有一个转录本（850 bp）,且丰度基本一致。利用cRT-PCR法克隆到nad6基因的转录本全长,发现其mRNA在基因组终止密码子之前-14和-15 bp处提前终止,即该基因无终止密码子。在atpA基因5’上游存在rrn18-rrn5基因簇,并且不育胞质比可育胞质缺失一个rrn18拷贝,推测rrn18基因与棉花CMS可能相关。本研究首次克隆到了棉花细胞质雄性不育胞质和可育胞质线粒体基因组中atpA基因的所有EcoRI和HindIII限制片段,获得两种胞质在atpA基因3’下游存在的差异序列,开发出用于鉴定可育胞质和不育胞质的SCAR和SSR标记,确定了CMS-D8胞质与其它CMS系之间的差异序列,开发出CMS-D8胞质特异SCAR分子标记。同时发现nad6基因3’部分编码序列成为短重复序列,并在CMS系线粒体基因组重排中发挥重要介导作用;发现不育胞质比可育胞质缺失一个rrn18基因拷贝;获得不育胞质中atpA全长拷贝和截短型拷贝以及nad6基因的转录本全长,并发现截短型atpA基因的编辑率在两种胞质间存在明显差异。这些结果为进一步克隆棉花细胞质雄性不育基因奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 高等植物线粒体基因组研究进展
• 1.1.1 线粒体基因组全测序的高等植物
• 1.1.2 植物线粒体基因组上的基因
• 1.1.3 高等植物线粒体基因组特点
• 1.1.4 展望
• 1.2 植物细胞质雄性不育相关基因研究进展
• 1.2.1 不同植物CMS 相关基因
• 1.2.2 CMS 相关基因的主要特点
• 1.3 本研究的目的和意义
• 1.4 本研究的策略和方法
• 第二章 陆地棉细胞质雄性不育胞质和可育胞质线粒体DNA 的RFLP 分析
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 试剂及仪器
• 2.1.3 引物
• 2.2 方法
• 2.2.1 改良CTAB 法提取棉花基因组
• 2.2.2 PCR 扩增线粒体基因
• 2.2.3 线粒体基因探针的标记
• 2.2.4 酶切基因组DNA
• 2.2.5 酶切产物的电泳
• 2.2.6 转膜
• 2.2.7 预杂交和杂交
• 2.2.8 洗涤尼龙膜
• 2.2.9 尼龙膜的封闭及与抗体反应
• 2.2.10 尼龙膜的洗涤及检测
• 2.3 结果分析
• 2.3.1 棉花线粒体基因PCR 结果
• 2.3.2 线粒体基因Southern blot 结果
• 2.4 讨论
• 2.4.1 棉花线粒体基因组DNA 的RFLP 标记
• 2.4.2 atpA 基因在棉花可育系和保持系及不同CMS 系间的RFLPs
• 2.4.3 不同CMS 系中atp6 和coxII 基因Southern blot 结果的比较分析
• 2.4.4 rrn18-rrn5 基因在棉花可育胞质和不育胞质间的 RFLP
• 2.4.5 Southern blot 实验要点讨论
• 2.5 小结
• 第三章 棉花可育胞质和不育胞质线粒体基因组中ATPA 基因侧翼序列的克隆
• 3.1 材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 引物
• 3.1.4 载体和菌株
• 3.2 方法
• 3.2.1 反向PCR（IPCR）扩增atpA 基因侧翼序列
• 3.2.2 TAIL-PCR 扩增atpA 基因侧翼序列
• 3.3 结果分析
• 3.3.1 优化的反向PCR 法扩增atpA 基因侧翼序列
• 3.3.2 atpA EcoRI 限制片段序列分析
• 3.3.3 TAIL-PCR 扩增结果
• 3.3.4 atpA HindIII 限制片段序列分析
• 3.3.5 CMS-D8 中atpA 基因EcoRI 限制片段的扩增
• 3.4 讨论
• 3.4.1 atpA 基因参与线粒体基因组DNA 重组
• 3.4.2 nad6 基因编码区中的27 bp 序列参与线粒体基因组DNA 重组
• 3.4.3 IPCR 结合TAIL-PCR 法扩增atpA 基因侧翼序列
• 3.5 小结
• 第四章棉花可育胞质和不育胞质SCAR和SSR分子标记的开发
• 4.1 材料
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 引物
• 4.2 方法
• 4.2.1 改良CTAB 法提取棉花基因组
• 4.2.2 分子标记分析
• 4.3 结果分析
• 4.3.1 SSR160 分子标记序列分析及扩增结果
• 4.3.2 SCAR555、SCAR515、SCARN6 分子标记序列分析及扩增结果
• 4.3.3 CMS-D8 特异分子标记SCARD8 的开发
• 4.4 讨论
• 4.4.1 SSR160 标记序列分析
• 4.4.2 SCAR515、SCAR555、SCARN6 标记序列分析
• 4.4.3 SCAR 标记和SSR 标记在鉴别植物胞质中的应用
• 4.5 小结
• 第五章 棉花ATPA 基因表达分析
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 试剂
• 5.1.3 载体和菌株
• 5.1.4 引物序列
• 5.1.5 改良硼酸法提取RNA
• 5.1.6 cDNA 第一链合成
• 5.1.7 RT-PCR 分析
• 5.1.8 cRT-PCR 分析
• 5.1.9 Northern blot 分析
• 5.2 结果分析
• 5.2.1 atpA 基因的RT-PCR 分析
• 5.2.2 棉花atpA 基因的RNA 编辑
• 5.2.3 棉花不育胞质atpA 基因全长拷贝和截短型拷贝cDNA 全长的克隆
• 5.2.4 atpA 基因在棉花不育系、保持系和恢复系中的Northern blot 分析
• 5.3 讨论
• 5.3.1 cRT-PCR 法克隆棉花线粒体atpA 转录本全长
• 5.3.2 棉花不同胞质atpA RNA 编辑率与CMS 的关系
• 5.4 小结
• 第六章 棉花NAD6 基因表达分析
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 试验材料、试剂、载体和菌株
• 6.1.2 引物序列
• 6.1.3 RNA 提取、Northern blot 分析、RT-PCR 分析、cRT-PCR 分析
• 6.2 结果分析
• 6.2.1 nad6 基因的Northern blot 分析
• 6.2.2 nad6 基因的RT-PCR 和cRT-PCR 分析
• 6.2.3 棉花nad6 基因序列分析
• 6.2.4 棉花nad6 基因的RNA 编辑
• 6.3 讨论
• 6.4 小结
• 结论
• 本研究的创新点
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历